一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法

1.本发明属于鱼类细胞原代培养技术领域，具体涉及一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法。


背景技术：

2.暗纹东方鲀（takifugu fasciatus），俗称河鲀，是我国江浙地区特色水产养殖品种，随着国家对河鲀食用解禁和纳入国家产业体系，产业发展不断加速。而随着暗纹东方鲀养殖业的蓬勃发展，寄生虫和细菌性等疾病频繁爆发，经济损失严重，极大限制了暗纹东方鲀产业的发展。由于暗纹东方鲀至今还没有建立稳定的细胞系，原代细胞成为新品种选育和病害防控等细胞水平研究过程中的首选材料。
3.鱼类肾脏是鱼体中重要的免疫器官，一般分为头肾和后肾，鱼类中头肾主要在造血和免疫应答中发挥作用，而后肾主要承担排泄与平衡渗透压的功能时具有造血功能。原代培养的肾细胞离体时间短，能很好的保留和维持鱼体细胞的原始状态和细胞功能，成功体外培养后可以比组织层面更精准的反应机体的免疫应答情况，是免疫分子功能研究的优选组织。多种鱼类已在原代肾细胞的基础之上建立了稳定的肾细胞系。目前还没有暗纹东方鲀肾细胞培养方法的报道。因此，通过暗纹东方鲀肾细胞的原代培养，在细胞层面研究病害发生的免疫和分子机制，对抗病新品种的选育和病害防控具有重大意义。
4.然而本实验室前期利用已报道的鱼类及哺乳动物细胞分离和培养方法，未能很好地获得暗纹东方鲀原代肾细胞，所培养的肾细胞贴壁缓慢、细胞形态差且存活时间短。经过对原代细胞培养方法的不断改进和创新，通过反复试验，我们最终实现了暗纹东方鲀原代肾细胞的稳定培养，此方法获得的原代肾细胞贴壁时间短、细胞形态良好均一、存活时间长，符合原代细胞培养要求且能进行一系列的下游实验，可用于暗纹东方鲀免疫学及相关的分子、细胞生物学研究。


技术实现要素：

5.为解决暗纹东方鲀肾细胞离体培养存在难贴壁、难存活的现象，本发明公开了一种稳定的暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）暗纹东方鲀稚鱼的选取：选取健康的暗纹东方鲀，在非应激状态下饥饿24小时；（2）细胞培养载体的预处理：使用多聚赖氨酸预处理细胞培养载体底面，细胞级无菌水清洗细胞培养载体底部，晾干细胞培养载体备用；（3）肾组织的处理：将肾组织放置于含青霉素-链霉素的d-hanks液中，清洗处理后剪碎；含青霉素-链霉素的d-hank’s液中青霉素-链霉素的浓度为2%（v/v）；（4）肾组织的消化：剪碎后的肾组织转移至含edta的胰蛋白酶中消化，消化后用细
胞滤网过滤，用含胎牛血清的细胞培养液冲洗细胞滤网，同时终止消化，离心后弃上清，得到细胞；含胎牛血清的细胞培养液包括：rmpi 1640 基础培养基中包含20%（v/v）胎牛血清、1%（v/v）青霉素-链霉素双抗溶液；（5）原代培养：向细胞中加入适量的完全培养液，用移液枪反复轻轻吹打混匀，将细胞悬液转入细胞培养载体中，置于细胞培养箱培养。
7.进一步地，步骤（1）中暗纹东方鲀稚鱼的体长为15
±
3cm，体重为100
±
20g。
8.进一步地，步骤（2）中细胞培养载体的预处理具体包括以下步骤：多聚赖氨酸用细胞培养级无菌水稀释为0.1mg/ml的浓度，浸润细胞培养载体底面30分钟后，用细胞培养级无菌水清洗，细胞培养载体底面仅留存一层极薄的多聚赖氨酸，无菌环境中12小时自然晾干备用。
9.进一步地，步骤（3）中，清洗处理时，需要仔细剔除肾动脉、肾静脉以及肾脏表膜并尽可能清洗组织中残余血液。
10.进一步地，步骤（4）中含edta胰蛋白酶的浓度为0.25%（w/v），剪碎的肾组织于37℃消化，消化时间为30-50分钟，优选40分钟（如在细胞培养温度28℃下消化肾组织不能达到理想的分离效果，延长消化时间会导致细胞受损，影响细胞的生长状态），消化期间每隔5min用无菌枪头轻轻搅拌混匀一次，消化后的肾组织成浆状，可以直接通过100
µ
m细胞滤网。
11.进一步地，步骤（5）中，完全培养液包括：rmpi1640基础培养液中加入胎牛血清、暗纹东方鲀血清、青霉素-链霉素双抗；完全培养液中，胎牛血清所占比例为15-20%（v/v），暗纹东方鲀血清所占比例为1-5%（v/v），青霉素-链霉素双抗溶液所占比例为1-3%（v/v）。
12.优选地，步骤（4）中完全培养液成分包括：rmpi1640基础培养液中加入胎牛血清20%（v/v）、暗纹东方鲀血清2%（v/v）和青霉素-链霉素双抗溶液1%（v/v）。
13.进一步地 ，所述青霉素-链霉素双抗溶液的浓度为1%（v/v）。
14.本发明的有益效果为：本发明成功培养了暗纹东方鲀的原代肾细胞，培养方法简单，培养所需材料易获取；利用多聚赖氨酸提前处理细胞培养载体，缩短了肾细胞贴壁时间，改善了细胞生长状态；合适的消化过程不仅让肾细胞得到很好的分离，而且保持了肾细胞的活力。利用本发明方法培养的暗纹东方鲀肾细胞生长形态良好，细胞状态稳定，为其他鱼类原代细胞培养提供参考方法。
附图说明
15.图1为实施例1中培养的暗纹东方鲀原代肾细胞光学显微镜照片（400
×
）；a，培养2d后；b，培养4d后；c，培养6d后；图2为实施例1中暗纹东方鲀原代肾细胞生长曲线；图3为实施例1中暗纹东方鲀原代肾细胞存活率；a，原代细胞培养1-7天的存活率；b，台盼蓝染色后细胞显微照片（黑色箭头为死亡细胞）；图4为实施例1、2和3中培养72h后的暗纹东方鲀原代肾细胞光学显微镜照片对比（400
×
）；a，实施例1；b，实施例2；c，实施例3。
具体实施方式
16.下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
17.实施例11. 一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，具体操作步骤为：（1）选取体重为100g的暗纹东方鲀幼鱼，使用ms-222麻醉、擦干鱼体，75%酒精消毒鱼体，无菌解剖，取出内脏团，剪去鱼鳔膜，使用纸巾将血液尽可能擦去，酒精棉擦拭肾脏表膜及周围区域1-3次，剪开肾脏表膜，取出两块完整肾脏，在含2%（v/v）青霉素-链霉素的 d-hank’s液中剪破肾组织并多次清洗至肾组织基本上呈粉白色并剔除黑色血管与残余肾脏表膜；（2）将处理好的肾脏放入装有500
µ
l含edta的2.5g/l浓度蛋白酶消化液的1.5ml离心管中，将肾脏剪碎1-3mm3大小。将肾脏组织连同消化液转移至水浴37℃消化40分钟，每5分钟用无菌枪头轻轻搅拌均匀一次；（3）消化后组织基本上成浆状，100目筛网放置于50ml离心管管口，组织悬液通过筛网并用三至五倍的含胎牛血清的细胞培养液冲洗筛网，消化后的浆状组织悬液可大部分直接通过100目筛网，残余少量组织用灭菌的研磨棒反复研磨后用完全培养液冲洗至50ml离心管管底。4℃ 1000rpm 离心5min，弃上清；（4）往细胞中加6ml完全培养液，在离心管中反复轻轻吹打混匀，将液体转移至多聚赖氨酸预处理的细胞培养载体六孔板中，补足6ml完全培养基至每孔达到2ml的培养液体积，左右轻轻晃动六孔板，倒置显微镜下观察细胞处于均匀的分散状态，放入28 ℃细胞培养箱中培养，24小时后沿孔侧壁轻轻吸走所有培养液，加入预热的完全培养液。其中完全培养液的配制方法：在500ml rmpi 1640基础培养液中加入100ml胎牛血清、10ml暗纹东方鲀血清和5ml青霉素-链霉素双抗溶液。所述青霉素-链霉素双抗溶液的最终浓度为1%（青霉素100 units/ml、链霉素100
ꢀµ
g /ml）；其中，细胞培养载体的预处理：多聚赖氨酸用细胞培养级无菌水稀释为0.1mg/ml的浓度，浸润细胞培养载体底面30分钟后，用细胞培养级无菌水清洗，细胞培养载体底面仅留存一层极薄的多聚赖氨酸，无菌环境中12小时自然晾干备用；（5）继续培养至2d、4d、6d，对贴壁细胞镜检和计数。如图1所示，细胞呈三角形或不规则多边形贴壁生长，细胞密度在2.7
×
106/ml左右，后续培养每天换液一次。
18.2.暗纹东方鲀原代肾细胞生长曲线将暗纹东方鲀原代肾细胞均分于24孔板中，置于温度为28℃，co2浓度为5%的培养箱中培养，从培养第1天开始至第7天每天取三孔，去除细胞培养液后，pbs清洗3次，利用胰蛋白酶消化10min，1000rpm离心收集弃上清，将每孔细胞总量浓缩至25μl的完全培养液中，三孔细胞分别于血细胞计数板上计数后取平均值，实验重复三次，生长曲线以培养天数作为横坐标，细胞数量作为纵坐标。如图2所示，暗纹东方鲀肾细胞于培养72小时后处于稳定状态。
19.3. 暗纹东方鲀原代肾细胞存活率细胞培养和收集方法同上，在去除旧细胞培养液以及利用pbs清洗后，统计剩余贴壁细胞中的细胞存活率。具体办法是：将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混匀，染色3min，
吸取少量细胞，置于血细胞计数板。根据细胞是否被染成蓝色，判断活细胞和死细胞个数，每份样品计数300个细胞。细胞存活率计算公式：活细胞数/细胞总数
×
100%。如图3所示，暗纹东方鲀肾细胞存活率均在80%以上。
20.实施例2一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，与实施例1的主要区别：步骤（2）中，肾脏组织连同消化液转移至水浴28℃消化40分钟。
21.步骤（3）中，消化后肾脏组织存在大量未消化的碎块。
22.步骤（5）中，72小时后，如图4b所示，细胞数量少，悬浮细胞较多，且有大量细胞碎屑占据贴壁细胞间隙。
23.实施例3一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，与实施例1的主要区别：步骤（4）中，将细胞悬液转移至六孔板（未经过多聚赖氨酸处理）中，完全培养液中不添加暗纹东方鲀血清。
24.步骤（5）中，72小时后，如图4c所示，细胞贴壁数量较少，细胞形态呈现不良状态，大量细胞开始死亡。
25.需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。