水稻根系伸长调控基因OsDRP1C的突变体、蛋白质、表达载体及其应用

水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体、蛋白质、表达载体及其应用
技术领域
1.本发明涉及水稻育种技术领域，具体而言，涉及水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体、蛋白质、表达载体及其应用。


背景技术：

2.水稻根系是水稻的重要组成部分，其不但是地上部的物理支撑，同时也是水稻从地下吸收营养成分和水分的重要器官。水稻根系构型为须根系，能不断地从茎节最靠近中柱维管的分生区细胞发生不定根，最后由数量众多的不定根及其侧根构成了它的根系结构。根型由长度、数量和空间范围等几个参数决定，研究发现根长决定了其他根系性状的遗传表现，是所有根系性状中最重要性状，单株产量等7个地上部农艺性状与根长呈极显著正相关。根系伸长的主要细胞学基础之一是根尖分生组织的细胞分裂，根尖分生组织功能或结构的缺陷会导致短根发生。根系的伸长另外一个主要细胞学基础是根尖伸长区细胞的伸长，这与细胞壁形成、纤维素的合成和微管组织形成等相关。尽管根长对植物产量和抗性有重要的作用，但由于根系生长在土壤里加大了研究的难度，使对根系伸长的遗传背景和分子机理所知甚少，使得在水稻育种与栽培上，根长的因素并没有被充分利用。因此，重点挖掘控制水稻根长的基因，分离、克隆一系列控制根长的基因便于定向改良水稻根系性状，如授权公告号为cn104031928b的发明专利，就公开了与水稻根系生长有关的基因oskasi，该基因oskasi及编码的蛋白质有些碱基和氨基酸发生突变，水稻根系表现为短根系。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻根系伸长调控基因osdrp1c，通过其dna序列中一个或几个碱基对错义突变，能抑制或促进水稻根系的伸长，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。
4.为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
5.基因osdrp1c在调控水稻根系伸长中的应用，为通过其dna序列中一个或几个碱基对错义突变，调控水稻根系的伸长；
6.所述基因osdrp1c在tigr中的编号为loc_os03g50520，含有如seq id no：1所示的核苷酸序列。
7.与现有技术相比，本发明通过调控tigr中的编号为loc_os03g50520的基因osdrp1c，通过其dna序列中一个或几个碱基对错义突变，抑制或促进水稻主根、不定根、侧根和根毛细胞的伸长，可实现对水稻根系伸长性能的调整。
8.一种水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体，该水稻根系伸长调控基因osdrp1c的核苷酸序列为在seq id no：1所示的基础上，所述dna序列2858bp处的碱基发生错义突变，胸腺嘧啶(t)被鸟嘌呤(a)取代。通过诱导基因osdrp1c的dna序列的2858位的胸腺嘧啶(t)被鸟嘌呤(a)取代，可使含有基因osdrp1c的突变体的水稻主根、不定根、侧根和根毛细
胞的伸长被抑制，使水稻根部生长缓慢。
9.一种水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体所编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列在seq id no：2所示的基础上，氨基酸序列的233位酪氨酸(tyr)突变为终止密码子。该水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体所编码的蛋白质，可使含有该蛋白质的水稻的根系的细胞的伸长被抑制，根部生长缓慢。
10.一种含有上述水稻根系伸长调控基因osdrp1c的表达载体。含有该水稻根系伸长调制基因osdrp1c的表达载体，可促进或抑制含有该表达载体的水稻的根系的伸长。
11.所述水稻根系伸长调控基因osdrp1c的表达载体在水稻根系性状改良方面的应用。将该表达载体应用在水稻根系性状改良方面，可优化水稻的根系性状。
12.所述水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体在调控水稻根系性状中的应用。将该稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体应用在调控水稻根系性状中，可使水稻根系表达为短根系。
附图说明
13.图1为野生型(wt)和osdrp1c突变体正常水培7天的表型比较图，a为7天苗龄的野生型(wt)和osdrp1c的突变体的全株照，bar＝2.0cm；b和c分别为wt和osdrp1c的主根在体视镜下的观测结果，bars＝1.0mm；
14.图2为野生型(wt)和osdrp1c突变体正常水培7天的主根树脂切片比较图；
15.图3为osdrp1c基因的图位克隆和基因结构图，a为基因osdrp1c的精细定位结果，rm1350n为定位所用到的ssr标记，in1、in2、in3和in4为新发展的多态标记，osjnba0014g15代表bac克隆，rec代表重组子；b为基因osdrp1c的结构和突变位点，内含子用实线表示，非翻译区用空心方框表示，外显子用实心方框表示，箭头指示突变位点；
16.图4为野生型(wt)、osdrp1c突变体和两株t2代转基因回复株系(ov1和ov2)的表型图；
17.图5为超表达转化载体pcambia1300改的结构示意图。
具体实施方式
18.下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
19.实施例1
20.本实施例提供了基因osdrp1c在调控水稻根系伸长中的应用，为通过其dna序列中一个或几个碱基对错义突变，调控水稻根系的伸长；
21.所述基因osdrp1c在tigr中的编号为loc_os03g50520，含有如seq id no：1所示的核苷酸序列。
22.与现有技术相比，本发明通过调控tigr中的编号为loc_os03g50520的基因osdrp1c，通过其dna序列中一个或几个碱基对错义突变导致根尖分生组织功能或结构的缺陷，抑制或促进水稻主根、不定根、侧根和根毛细胞的伸长，可实现对水稻根系伸长性能的调整。
23.实施例2
24.本实施例提供了一种水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体及其所编码的蛋白质，该水稻根系伸长调控基因osdrp1c的核苷酸序列为在seq id no：1所示的基础上，所述dna序列2858bp处的碱基发生错义突变，胸腺嘧啶(t)被鸟嘌呤(a)取代；所述蛋白质的氨基酸序列在seq id no：2所示的基础上，氨基酸序列的233位酪氨酸(tyr)突变为终止密码子。
25.通过诱导基因osdrp1c的dna序列的2858位的胸腺嘧啶(t)被鸟嘌呤(a)取代，相应地所编码的蛋白质的氨基酸序列的233位酪氨酸(tyr)突变为终止密码子，可使含有基因osdrp1c的突变体或其所编码的蛋白质的水稻主根、不定根、侧根和根毛细胞的伸长被抑制，使水稻根部生长缓慢。
26.本实施例还提供的水稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体在调控水稻根系性状中的应用。将该稻根系伸长调控基因osdrp1c的突变体应用在调控水稻根系性状中，可使水稻根系表达为短根系。
27.实施例3突变体的表型及遗传分析
28.从甲基磺酸乙酯诱变的籼稻(oryza sativa l.ssp indica)品种kasalath突变体库中筛选到一个水稻短根系突变体osdrp1c。7天苗龄的osdrp1c突变体的根系伸长受到严重抑制，主根、不定根、侧根和根毛都变短(图1)。突变体osdrp1c细胞伸长受到抑制导致主根长度较野生型明显变短，突变体成熟区与伸长区的细胞较宽但分生区细胞略窄，导致突变体根系变粗但根尖略小(图2)。因此，osdrp1c基因可通过控制水稻根系细胞的长度与宽度，进一步调控根系的生长发育。以突变体突变体osdrp1c为父本，与野生型kasalath杂交，获得子一代f1植株与野生型kasalath完全一致，说明osdrp1c为隐性突变。f1代自花授粉所得的f2中，正常植株与短根植株的分离比为379/131＝2.89，卡方检测结果为0.13《χ
20.05,1
＝3.84，正常植株与短根植株的比例符合一对基因控制的3：1分离比，表明该突变体是隐性单基因突变体。
29.实施例4osdrp1c基因的定位
30.从突变体osdrp1c和nipponbare的杂交后代f2中分离出短根突变个体，利用基因图位克隆法(map-based cloning)对突变基因进行定位。初定位(30个f2突变个体)将突变基因定位在第3染色体ssr标记为rm1350n和rm5813n之间。之后，扩大定位群体，并在该区间内发展了4对有多态的新的indel分子标记，分别命名为in1，in2，in3和in4，序列如下：
31.in1u-5’acctcctcctccgccagctcc 3’32.in1l-5’aaatctcctcgcccttcttccc 3’33.in2u-5’tgcccactgattagccgtag 3’34.in2l-5’ggatagagatgcccatagatttg 3’35.in3u-5’gcggtgtttatcagattggt 3’36.in3l-5’taaatagatactccatcggctta 3’37.in4u-5’cgccaatggtgtgtaggagga 3’38.in4l-5’ccgttatgccgtccacagatg 3’39.最终将基因锁定在indel标记为in2和in3(第3染色体上具体物理位置分别为28821343bp和28952920bp)之间，重组子分别为3/1112和3/1112，且重组的号码不同。该区间有131.2kb大小(图3)。
40.实施例5基因预测和序列分析
41.根据精细定位的结果，osdrp1c基因位于bac克隆osjnba0014g15上(图3)。根据tigr(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息，对定位的染色体区段内基因预测分析，该区间共有19个预测的基因，用kasalath野生型和osdrp1c突变体dna模板对候选的19个基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现基因号为loc_os03g50520(dynamin相关蛋白)基因的dna序列的2858bp的胸腺嘧啶(t)被鸟嘌呤(a)取代，从而导致编码的氨基酸序列的233位酪氨酸(tyr)突变为终止密码子，命名该基因为osdrp1c。
42.实施例6osdrp1c功能互补实验
43.根据osdrp1c基因的cds序列信息，设计扩增完整cds的引物，引物序列如下(加下划线的为酶切位点)：
44.osdrp1c-cdsu：5’tgagccggagactacagcgac 3’45.osdrp1c-cdsl：5’aaccgatcatttccacgcgac 3’；
46.osdrp1c-ovu：5’aaagagctcctttgcccgagatggcgacga3’47.osdrp1c-ovl：5’aaatctagaaaccgatcatttccacgcgac3’；
48.采用上海生工rna提取试剂盒(sk1321)提取水稻kasalash叶片总rna，以oligo(dt)-18为引物，以所提取的总rna为模板进行反转录合成第一链cdna。以此cdna为模板，osdrp1c-cdsu与osdrp1c-cdsl为引物，利用primestar hs dna polymerase扩增全长orf，pcr条件：98℃预变性10s，然后进入循环反应(98℃10s，58℃10s，72℃，2min)，循环数为30，最后再延伸10min结束。琼脂糖电泳割胶回收pcr产物，纯化并连接到peasy-blunt simple cloning vector载体。连接产物热击转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃培养16h后挑阳性单克隆测序，测序鉴定序列无误后，以此重组载体为模板，osdrp1c-ovu与osdrp1c-ovl为引物，利用primestar hs dna polymerase扩增全长orf，pcr条件：98℃预变性10s，然后进入循环反应(98℃10s，58℃10s，72℃，2min)，循环数为30，最后再延伸10min结束。琼脂糖电泳割胶回收pcr产物，再用saci和xbai在37℃双酶切过夜，连入经同样双酶切的pcambia1300改(35s)载体中(图5)，命名为35s-osdrp1cover。连接产物以相同的方法热击转化大肠杆菌dh5α感受态，涂布在含有kan抗性的lb平板培养16h后挑取单克隆，摇菌抽提质粒双酶切并通过琼脂糖胶检测正确后电击转化农杆菌eha105。
49.酶切检测正确的质粒通过农杆菌株系eha105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体osdrp1c中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌(eha105)介导的水稻遗传转化体系主要应用hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。该转基因植株中分离的osdrp1c突变体的根系长度恢复成野生型(图4)，说明osdrp1c的表型确实是有osdrp1c突变引起的。
50.虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。