一种膀胱癌干细胞生物标志物组及其应用

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种膀胱癌干细胞生物标志物组及其应用。


背景技术：

2.膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。2020年全球新增57万膀胱癌新发病例，21万膀胱癌死亡病例，且发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势，其中男性约占总体疾病负担的75％。在美国，膀胱癌发病率位居第四，男性患者的数量为女性的四倍。在我国，膀胱癌的发病率为6.69/10万，而且发病率呈现出增加的趋势，严重威胁我国人民尤其是男性的身体健康。膀胱癌因性别、种族和地域的不同会产生较大的差异，它可以在所有年龄段发生，其高发年龄为50-70岁，并且患者的患病率与年龄呈正比。
3.膀胱癌主要包括移行细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌，其中超过90％的膀胱癌患者被确诊为移行细胞癌。浅表性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,nmibc)和肌层浸润性膀胱(muscle-invasive bladder cancer,mibc)是移行细胞癌的两种主要类型，手术治疗联合放化疗是临床上最常见的膀胱癌治疗方法。其中，nmibc患者(～70％)术后预后较好，但复发率较高(31％-78％；mibc患者(～30％)术后预后较差，5年生存率小于35％，且易发生局部或远端转移。因此，非靶向、非特异性治疗所导致的耐药和复发，仍是膀胱癌临床治疗的最大问题。
4.肿瘤干细胞(cancer stem cells,csc)是一小部分具有肿瘤启动能力的肿瘤细胞，是肿瘤发生的核心来源。肿瘤干细胞是肿瘤细胞的一个亚群，它们具有干细胞的特性，包括自我更新能力和肿瘤起始能力，肿瘤干细胞与肿瘤的异质性、发生发展、复发和转移以及耐药性有着密切的关系。肿瘤干细胞具有自我保护能力。有研究证明，肿瘤干细胞处于静止状态，通常在细胞周期的g0/g1期，并具有较高的dna修复能力，表达高水平的抗凋亡蛋白。肿瘤干细胞还会表达高水平的abcg2蛋白，这种蛋白可以和细胞毒性药物一起泵出细胞，从而避免化学疗法药物对细胞产生的破坏作用。肿瘤干细胞已被证实可以对常规治疗产生耐药性，如化疗、放疗和靶向治疗等。按照传统治疗方法，治疗药物主要是杀死分裂中的肿瘤细胞，但由于肿瘤干细胞通常处于静止状态，肿瘤治疗药物无法有效将其杀死，所以传统药物对肿瘤治疗的效果是非常有限的。此外，这些治疗手段还可能会对肿瘤治疗产生反效果，导致具有耐药性的肿瘤干细胞过度生长。目前靶向肿瘤干细胞的治疗手段已有了一定的突破，例如，已经发现在80％的前列腺癌干细胞中表达着特定的抗原，是前列腺癌治疗的有效靶点。静脉注射靶向前列腺癌干细胞特异性抗原的抗体，可以有效延长小鼠的生存时间，并基本抑制了前列腺癌的转移。因此，靶向肿瘤干细胞在肿瘤治疗中有着非常重大的意义。
5.膀胱癌具有治疗后容易复发的特点，临床治疗中的复发率高。膀胱癌干细胞对肿瘤生长、转移和复发起着重要的作用，因此膀胱癌干细胞基因表达特征的鉴定对膀胱癌的精准治疗有着重要意义。因而，深入探究膀胱癌干细胞的生物标志物，对于膀胱癌的诊断、预后判断和靶向治疗具有重要的意义和实际应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种膀胱癌干细胞生物标志物组及其应用，通过生物标志物组能够识别或鉴定膀胱癌干细胞，进一步用于膀胱癌的辅助诊断、预后判断、靶向治疗，以及提供相关的检测试剂或试剂盒。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种膀胱癌干细胞生物标志物组，所述生物标志物组包括特征基因或者特征蛋白中的一种或者几种，所述生物标志物组应用于膀胱癌的辅助诊断、预后判断和靶向治疗；
9.所述特征基因包括：clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e；
10.所述特征蛋白为所述特征基因编码表达的蛋白或蛋白片段。
11.一种膀胱癌干细胞检测试剂，所述检测试剂包含结合剂，所述结合剂与所述特征基因或者所述特征蛋白特异性结合，所述检测试剂用于识别或鉴定膀胱癌干细胞。
12.进一步地，所述结合剂包括核酸和/或抗体。
13.进一步地，所述核酸为与所述特征基因特异性结合的核酸探针或配体。
14.进一步地，所述核酸为特异性扩增所述特征基因的引物。
15.进一步地，所述抗体为与所述特征蛋白特异性结合的抗体。
16.进一步地，所述结合剂还包括指示分子。
17.进一步地，所述指示分子为荧光物质、放射性物质和酶中的一种或者几种。
18.进一步地，所述检测试剂用于膀胱癌的辅助诊断、预后判断和靶向治疗。
19.一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含所述的检测试剂，所述检测试剂盒用于识别或鉴定膀胱癌干细胞。
20.本发明利用单细胞转录组测序分析技术，通过对cd44
+
t24细胞进了单细胞转录组测序，筛选出4种特异性表达在该膀胱癌干细胞亚群中的特征基因，根据该特征基因，可以引申出一系列与该基因或该基因表达的蛋白产物相结合的核酸、配体、酶、底物，和/或抗体，能够鉴识别定肿瘤中的膀胱癌干细胞亚群，膀胱癌干细胞亚群可以反应肿瘤的免疫状态，可以用于肿瘤辅助诊断、预后判断、靶向治疗的药物制备，在膀胱癌诊断和治疗领域具有重要的应用价值。
附图说明
21.图1：t24细胞的cd44染色和分选结果示意图；
22.图2:cd44
+
和cd44-t24细胞单细胞测序的t-sne示意图；
23.图3：cd44
+
t24细胞cluster 1的信号通路富集情况示意图；
24.图4：cd44
+
t24细胞各亚群中clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e基因的表达量示意图；
25.图5：从原代膀胱癌样本中分选膀胱癌干细胞的流式分选结果示意图；
26.图6：qpcr检测膀胱癌干细胞及非干细胞中特征基因的表达量示意图；
27.图7：膀胱癌干细胞成球实验结果示意图；
28.图8：qpcr检测膀胱癌干细胞球及非干细胞球中特征基因的表达量示意图；
29.图9：敲低clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e抑制膀胱癌细胞增殖的示意图；
30.图10：clec4e等特征基因表达与膀胱癌患者总生存期关系示意图；
31.图11：qpcr检测膀胱癌和癌旁组织中特征基因的表达量示意图。
acaccctgca gtggatgcat ggctgcgagc tggggcccga cgggcgcttc ctccgcgggt atgaacagtt cgcctacgac ggcaaggatt atctcaccct gaatgaggac ctgcgctcct ggaccgcggt ggacacggcg gctcagatct ccgagcaaaa gtcaaatgat gcctctgagg cggagcacca gagagcctac ctggaagaca catgcgtgga gtggctccac aaatacctgg agaaggggaa ggagacgctg cttcacctgg agcccccaaa gacacacgtg actcaccacc ccatctctga ccatgaggcc accctgaggt gctgggccct gggcttctac cctgcggaga tcacactgac ctggcagcag gatggggagg gccataccca ggacacggag ctcgtggaga ccaggcctgc aggggatgga accttccaga agtgggcagc tgtggtggtg ccttctggag aggagcagag atacacgtgc catgtgcagc atgaggggct acccgagccc gtcaccctga gatggaagcc ggcttcccag cccaccatcc ccatcgtggg catcattgct ggcctggttc tccttggatc tgtggtctct ggagctgtgg ttgctgctgt gatatggagg aagaagagct caggtggaaa aggagggagc tactctaagg ctgagtggag cgacagtgcc caggggtctg agtctcacag cttgtaa
71.实施例1
72.单细胞转录组测序：
73.1、cd44
+
t24细胞和的cd44-t24细胞分离；
74.预留不染色的细胞作为空白对照。
75.(1)染色：在200μl细胞悬液中，加入5μl cd44抗体，4℃避光染色30min。
76.(2)洗涤：将染色完毕的细胞悬液移入离心管中，1000r/min，离心5min后弃上清，收集细胞沉淀；将沉淀用pbs重悬，1000r/min，离心5min后弃上清，收集细胞沉淀，再加入750μl无血清培养基重悬细胞，之后转移到流式分选管中准备分选。
77.(3)分选：通过流式细胞术，将cd44
+
t24细胞(膀胱癌干细胞)及cd44-t24细胞分别分选到2ml无血清培养基中，之后转移到低吸附的六孔板中培养。分选结果如图1所示。
78.2、利用10x genomics测序平台对单细胞转录组测序；
79.(1)将上述分离得到的cd44
+
t24和cd44-t24细胞样本制备成浓度为700～1200cells/μl的细胞悬液。
80.(2)将细胞悬液与含有barcode序列的gelbeads混合，加载到10x genomics单细胞液滴生成平台，gel beads中barcode用来标记细胞(一个beads上只有一种barcode)，umi用来标记基因并记录基因的表达量，细胞悬液通过第一个进样口与酶等反应物混合。
81.(3)混合物进入第二个进样口时被油滴包裹，形成gems。gems形成后细胞立即裂解。gelbeads随即溶解释放反转录随机引物进行反转录。
82.(4)反转录后，油滴破裂，将释放的cdna产物收集起来，并在与3’末端模板转换引物互补的引物作用下进行pcr扩增。
83.(5)扩增后的cdna经过打断，加a，加illumina p5和p7接头，完成文库制备后在illumina hiseq 2000平台上进行pe150测序。
84.实施例2
85.cd44
+
t24细胞亚群的基因表达量分析：
86.通过单细胞转录组测序，根据cellranger数据统计，seurat标准化、降维、聚类等对测序结果进行分析，根据细胞间基因表达情况进行聚类。聚类分析用于识别细胞亚型。根据聚类结果，采用t-sne降维算法，在二维空间上展示细胞的分布情况，具体分析方法如下：
87.⑴
数据标准化和降噪
88.seurat默认采用全局归一化方法“lognormalize”对基因表达矩阵进行标准化，对于每个细胞，分别将每个基因的表达量除以该细胞的整体表达量，即转换为相对丰度，然后乘以归一化因子(默认10000)，再进行log转化。数据标准化之后，再运用seurat提取出在细胞间变异系数较大的基因，并基于这些基因进行下游分析。在进行下游的降维和聚类分析之前，为进一步降低因技术噪音、批次效应或细胞周期等造成的系统误差，我们需要通过seurat构建线性模型来消除这些变异来源。
89.⑵
聚类分析
90.聚类分析用于识别细胞亚型。在seurat中，首先进行pca主成分分析，然后评估最显著的主成分，挑选贡献最大的几个主成分进行聚类分析。聚类时采用graph-based聚类算法，其通过欧几里得距离构建k近邻(knn)图，默认采用louvain算法对细胞进行分组和模块优化。根据聚类结果，采用t-sne降维算法，在二维空间上展示细胞的分布情况。依据已发表的文献或细胞标志物数据库，对cd44
+
t24和cd44-t24细胞进行细胞亚群定义。结果参见图2。
91.实施例3
92.膀胱癌干细胞差异表达基因的通路富集分析：
93.基因通路富集分析是分析基因在细胞中的代谢途径以及其功能的过程，本发明中，利用matescape对差异表达基因进行通路富集分析。metascape是提供基因注释和分析资源的门户网站，网址为http://metascape.org，集成了四十多个生物信息数据库，例如go/kegg terms，canonical pathways，hall mark gene sets，uniprot和drugbank等常用数据库都包括在内。我们可以方便地运用此网站进行生物通路功能富集分析，蛋白质互作用网络结构分析。我们通过在网站首页提交需要分析的cluster的差异基因列表，选择物种信息为h.sapiens，再点击分析选项即可得到可视化功能富集分析和蛋白质互作分析结果，所有的数据可通过一个zip文件包下载保存。对实施例2中得到的16个细胞亚群进行通路富集分析，其中cluster 1得到了有效的信号通路富集结果，结果参见图3。分析结果表明，cd44+ t24细胞差异表达基因多富集在黏着斑激酶信号通路、pi3k-akt信号通路、ecm受体相互作用等通路。
94.实施例4
95.膀胱癌干细胞标志物分析：
96.为了进一步分析cd44
+
t24细胞cluster 1基因表达情况(表1)，筛选出特异性表达在膜上的基因，我们通过将该亚群与样品中其他所有细胞亚群进行比较，得到该亚群与其他亚群之间的差异基因列表，利用差异分析算法(默认采用wilcoxon rank sun test)，寻找该亚群的差异高表达基因，为进一步筛选特征基因提供依据。进一步地，特征基因仅在该亚群中高表达(ave_logfc值＞0.25)，在其他亚群中表达量较低(p值《0.05)。
97.表1 cd44
+
t24细胞亚群cluster 1的差异表达基因
[0098][0099][0100]
*所述基因表达量为ave_logfc，与该样品中其他细胞亚群表达量差异的log值经
筛选，cd44
+
t24细胞特征基因为clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e。
[0101]
对基因表达量进行分析，绘制柱形图，结果参见图4。
[0102]
clec4e(c-type lectin domain family 4member e)是编码c型凝集素结构域家族4成员e的基因，该蛋白具有多种功能，如细胞粘附、细胞信号传递、糖蛋白转换以及在炎症和免疫反应中发挥作用。有研究表明，clec4e可以通过激活clec4e-syk-nfκb信号通路促进肿瘤进展。
[0103]
hbegf(heparin binding egf like growth factor)是编码肝素结合egf样生长因子的基因。其相关通路包括ptk6和ret信号通路。hbegf主要功能为促进细胞增殖，研究表明，hbegf可能参与巨噬细胞介导的细胞增殖，成纤维细胞有丝分裂等。它能够与egf/egfr受体结合，比egf本身具有更高的亲和力，比egf有着更有效的促分裂功能。
[0104]
ifitm3(interferon induced transmembrane protein 3)编码的蛋白是一种干扰素诱导的膜蛋白，与ifitm3相关的疾病包括流感等，其中相关途径包括干扰素信号转导和先天免疫系统。ifitm3蛋白可以破坏细胞内胆固醇的稳态，组织病毒与胆固醇耗尽的核内体融合，抑制病毒进入细胞。研究表明，ifitm3在多种肿瘤中高表达，并与肿瘤的病理分化程度呈正相关，参与肿瘤发生、发展及扩散、转移等过程。
[0105]
hla-e(major histocompatibility complex,class i,e)是编码主要组织相容性复合体，i类，e蛋白的基因，与hla-e相关的疾病包括bk病毒肾病和巨细胞感染。相关途径包括抗原处理和交叉呈递等。该蛋白主要参与免疫识别，可以形成自然杀伤细胞抑制受体的配体复合物，使细胞自身对自然杀伤细胞产生耐受性，诱导hla-e依赖的nk细胞对病变细胞的免疫耐受。
[0106]
实施例5
[0107]
膀胱癌干细胞的富集及特征基因测定：
[0108]
1.分选膀胱癌干细胞；
[0109]
收集5例新鲜膀胱癌组织，对组织进行剪碎和消化，制备单细胞悬液。pbs洗涤2次，200μl无血清dmem/f12重悬，计数备用。
[0110]
在200μl细胞悬液中，加入5μl cd44抗体，4℃避光染色30min。
[0111]
将染色完毕的细胞悬液移入离心管中，1000r/min，离心5min后弃上清，收集细胞沉淀；将沉淀用pbs重悬，1000r/min，离心5min后弃上清，收集细胞沉淀，再加入750μl无血清培养基重悬细胞，之后转移到流式分选管中准备分选。
[0112]
通过流式细胞术，将肿瘤干细胞(cd44
+
细胞)及非干细胞(cd44-细胞)各分选到2ml无血清培养基中备用。代表性的流式分选结果如图5所示。
[0113]
2.qpcr测定膀胱癌干细胞和非干细胞特征基因表达量；
[0114]
(1)总rna提取；
[0115]
将步骤1中分选出的细胞3000rpm离心3min，收集细胞沉淀。按照天根的培养细胞/细菌总rna提取试剂盒(dp430)中的步骤提取总rna。
[0116]
①
裂解：将分选好的膀胱癌干细胞和非干细胞离心收集后，加300μl裂解液rl(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)混匀。
[0117]
②
将所有溶液转移至过滤柱cs上(过滤柱cs放在收集管中)，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，收集滤液。
[0118]
③
向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μl或600μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中(吸附柱cr3放入收集管中)，12,000rpm(～13,400
×
g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
[0119]
④
向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400
×
g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
[0120]
⑤
dnase i工作液的配制：取10μl dnase i储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μl rdd溶液，轻柔混匀。
[0121]
⑥
向吸附柱cr3中央加入80μl的dnase i工作液，室温放置15min。
[0122]
⑦
向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400
×
g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
[0123]
⑧
向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱cr3放回收集管中。重复一次。
[0124]
⑨
12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0125]
⑩
将吸附柱cr3转入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl rnase-free ddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，得到rna溶液。利用nanodrop 2000测定提取总rna的浓度加入适量裂解液，将所有溶液转移至过滤柱cs上，12000rpm离心2min，收集滤液。向滤液中加入1倍体积的70％乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀仪器转入吸附柱cr3中，12000rpm离心2min，倒掉废液。向吸附柱中加入去蛋白液，1200rpm离心30-60sec，倒掉废液。向吸附柱中加入dnase工作液，室温放置15min，再加入去蛋白液，12000rpm离心2min，倒掉废液。向吸附柱中加入漂洗液，12000rpm离心2min，倒掉废液，重复一次。将吸附柱置于60℃恒温器5min，彻底晾干残留的漂洗液。将吸附柱转移到新的rnase-free离心管中，加入30-50μl rnase-free双蒸水，12000rpm离心2min，得到rna溶液。
[0126]
(2)反转录；
[0127]
gdna去除反应体系：
[0128][0129][0130]
从(1)所得的rna溶液中用rna专用移液枪取出3-5μl于离心管pcr管中，用于测定该rna溶液的浓度。总rna的量应在1-2mg之间，根据rna溶液的浓度确定gdna去除体系中total rna的用量。
[0131]
gdna去除反应体系配好后置于42℃，孵育3min，然后置于冰上放置。
[0132]
反转录反应体系:
[0133]
试剂使用量10x king rt buffer2μlfastking rt enzyme mix1μlfq-rt primer mix2μlrnase-free ddh2o补足到10μl
[0134]
将反转录反应中的mix加到gdna去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃孵育15min，95℃孵育3min之后置于冰上，得到的cdna可用于后续试验或低温保存。
[0135]
(3)荧光定量pcr检测特征基因表达量；
[0136]
以(2)中得到的cdna为模板进行荧光定量pcr检测特征基因表达量。
[0137]
反应体系：
[0138]
试剂使用量2x superreal premix plus10μl正向引物0.5μl反向引物0.5μlcdna模板0.5μlrnase free ddh2o8.2μl50x rox reference dye0.3μl
[0139]
引物序列：
[0140][0141][0142]
荧光定量pcr条件如下：
[0143][0144]
qpcr检测膀胱癌干细胞和非干细胞中clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e的表达量，结果参见图6。结果表明，clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e在膀胱癌干细胞中的表达量显著高于
非干细胞。
[0145]
3.膀胱癌干细胞小球培养；
[0146]
利用无血清dmem/f12培养基重悬cd44
+
t24细胞，利用无血清培养体系(ko dmem/f12、20ng/ml n2 supplement、20ng/ml b27 supplement、20ng/ml bfgf、20ng/ml egf)，在低吸附六孔板中培养cd44
+
和cd44-t24细胞(5
×
104个/孔)。每隔两天添加新鲜培养基，连续培养10-14天。结果显示，cd44
+
t24细胞具有肿瘤球形成能力和自我更新能力(参见图7)。
[0147]
4.qpcr测定膀胱癌干细胞球和非干细胞球中特征基因表达量；
[0148]
收集步骤3中膀胱癌干细胞球和非干细胞球，3000rpm离心3min，收集细胞沉淀。按照步骤3的方法提取总rna并做反转录和qpcr检测。结果表明，clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e在膀胱癌干细胞球中的表达量显著高于非干细胞球(参见图8)。
[0149]
实施例6
[0150]
膀胱癌干细胞特征基因功能鉴定：
[0151]
1、sirna干扰；
[0152]
为了验证膀胱癌干细胞特征基因的功能，合成靶向clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e的sirna，并转染至膀胱癌细胞。
[0153]
(1)将2
×
105个j82细胞接种到六孔细胞培养板中，在六孔板中利用2ml的1640完全培养基进行培养。
[0154]
(2)细胞完全贴壁后，弃去六孔板中的液体，利用纯dmem培养基对细胞进行2h的饥饿培养。
[0155]
(3)将5μl的sirna加至250μl的dmem培基中混匀，室温静置5min，获得混合溶液a。
[0156]
(4)向250μl的纯dmem培基中加入10μl的lipo2000，涡旋混匀，室温静置10min，获得混合溶液b。
[0157]
(5)将含有sirna的混合溶液a与含有lipo2000的混合溶液b混合均匀，将混合液室温静置20min。
[0158]
(6)将静置完成的混合液均匀滴加至六孔板的各个孔中，确保混合液分散均匀，将六孔板培养于在37℃细胞培养箱。
[0159]
(7)4-6h的共培养结束后，弃去六孔板中所有培养基，在仅含血清的rpmi培养基的体系下，继续对细胞进行48h的培养。
[0160]
2、细胞毒性实验；
[0161]
(1)将t25瓶中的j82细胞用0.25％胰酶消化细胞。等到细胞呈圆形，但未完全脱离时，通过添加完全培养基将胰酶稀释至0.05％以终止消化。通过离心机以1000rpm的转速进行3min的离心，用完全培养基重悬细胞得到细胞悬液。
[0162]
(2)对细胞悬液中含有的细胞总数进行计算，通过向细胞悬液中添加rpmi完全培养基对细胞悬液进行稀释，将两种细胞稀释至浓度为5
×
104个/ml。
[0163]
(3)在96孔板的每孔中加入100μl细胞稀释液，并将96孔板在培养箱中过夜培养。
[0164]
(4)继续培养24h、48h和72h。
[0165]
(5)达到预计的孵育时间后，弃去残留在96孔细胞板中的培养基，加入100μl mtt浓度0.5mg/ml的rpmi溶液，继续孵育4h。
[0166]
(6)测定96孔细胞培养板中各孔在570nm处的吸光度。
[0167]
结果显示，clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e的敲低显著抑制膀胱癌细胞的增殖(参见图9)，是膀胱癌治疗的潜在靶标。
[0168]
实施例7
[0169]
膀胱癌干细胞特征基因与膀胱癌预后的关系：
[0170]
对于上述筛选的cd44
+ t24细胞的特征基因，运用gene expression profiling interactive analysis(gepia2)在线分析工具(http://www.oncolnc.org/)对预后进行分析，使用的数据库为膀胱尿路上皮癌(blca)数据。gepia是基于tcga和gtex数据库中的肿瘤和正常样本进行基因表达分析的工具。gepia2是gepia的增强和更新版本，具有更高的分辨率和更多的功能。gepia2涵盖了84种癌症亚型，将基因表达定量从基因水平扩展到转录本水平，并支持特定癌症亚型的分析以及亚型之间的比较。此外随着单细胞测序的广泛应用，gepia2还采用新的基因特征量化分析技术，从而让用户得到不同癌症类型细胞亚群特征基因的分布，是强大的癌症基因组学数据工具。
[0171]
tcga(the cancer genome atlas)是由美国在2005年发起的癌症和肿瘤基因图谱计划，旨在应用基因组分析技术研究癌症中的基因组变化，做了大规模的基因组测序，样本量过万，包含了三十多种癌症。gtex(genotype-tissue expression是正常组织转录组测序的数据库。通常，我们使用tcga进行数据分析时，会发现该项目纳入的正常组织转录组测序数据非常少，这个时候我们需要加入gtex数据库数据，二者结合进行分析，数据分析结果如图10所示。
[0172]
分析结果表明，clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e高表达的cd44
+
t24细胞亚群与膀胱癌患者更短的总生存期相关(p＝0.036)。以上结果表明，膀胱癌中clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e高表达的cd44
+
膀胱癌干细胞亚群显著影响膀胱癌患者的临床结局，提示了更差的预后。这一发现可帮助临床医生认识疾病发展规律，提前对患者进行干预治疗，改善不良的治疗预后。
[0173]
实施例8
[0174]
利用膀胱癌干细胞特征基因进行膀胱癌辅助诊断：
[0175]
选取50对人膀胱癌组织和癌旁组织(由中日友好医院提供)，按天根的动物组织总rna提取试剂盒(dp431)的步骤提取总rna，再利用nanodrop 2000测定rna浓度和纯度。对提取的总rna进行反转录，合成cdna。采用本发明实施例1提供的膀胱癌干细胞鉴定试剂盒，以反转录的cdna为模板进行荧光定量pcr扩增。
[0176]
荧光定量pcr扩增的体系和条件与实施例5所用体系和条件相同。
[0177]
检测结果如图11和表2、表3、表4、表5所示。
[0178]
如图11所示，荧光定量pcr检测膀胱癌干细胞和非干细胞中clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e的表达量，产物扩增曲线在反应的早期就可能被监测到，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为ct值。根据δct值(靶基因ct值-内参基因ct值)可以预测靶基因产物的起始浓度，即在pcr反应条件相同的情况下，靶基因起始浓度越大，则δct值就越低。
[0179]
将癌旁对照组中clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e的δct均值的95％可信区间的上界(x
±
sd)作为本诊断实验的临界值(cut-off值)，其值分别为14.79、9.38、1.02、4.11。检测结果如表2、表3、表4、表5所示，在此分界值条件下，利用clec4e诊断膀胱癌的灵敏度为
94％，特异度为90％；利用hbegf诊断膀胱癌的灵敏度为96％，特异度为94％；利用ifitm3诊断膀胱癌的灵敏度为92％，特异度为94％；利用hla-e诊断膀胱癌的灵敏度为88％，特异度为92％。
[0180]
表2利用clec4e诊断膀胱癌
[0181][0182]
临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力，灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例。本实验灵敏度＝47/(47+3)
×
％＝94％。临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力，特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。本实验特异度＝45/(45+5)
×
％＝90％。
[0183]
表3利用hbegf诊断膀胱癌
[0184][0185]
本实验灵敏度＝48/(48+2)
×
％＝96％，特异度＝47/(47+3)
×
％＝94％。
[0186]
表4利用ifitm3诊断膀胱癌
[0187][0188]
本实验灵敏度＝46/(46+4)
×
％＝92％，特异度＝47/(47+3)
×
％＝94％。
[0189]
表5利用hla-e诊断膀胱癌
[0190][0191][0192]
本实验灵敏度＝48/(44+6)
×
％＝88％，特异度＝46/(46+4)
×
％＝92％。
[0193]
因此，clec4e、hbegf、ifitm3、hla-e是全新的膀胱癌干细胞的生物标志物，在鉴定膀胱癌干细胞、诊断膀胱癌等方面有良好的应用前景，并有望成为膀胱癌靶向治疗的新靶点。
[0194]
以上实施例对本发明所公开的一种膀胱癌干细胞生物标志物组及其应用，进行了进一步阐述和说明，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想，对于本领域的一般技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。