一种冻存脐带血Treg细胞的体外扩增方法与流程

一种冻存脐带血treg细胞的体外扩增方法
技术领域
1.本发明涉及脐带血体外扩增方法，尤其是一种冻存脐带血treg细胞的体外扩增方法。


背景技术：

2.调节性t细胞(regulatory t cell，treg)是一类具有免疫抑制作用的t淋巴细胞亚群，是维持机体免疫耐受的重要调控者。机体内cd4
+
cd25
+
treg细胞仅占cd4
+
t细胞的5～10％，占人外周血单个核细胞只有1～2％。为了获得足量临床应用的细胞，需要在体外大量扩增treg细胞。目前体外扩增获得treg细胞的一般方法是将新鲜脐带血或外周血通过淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，再将单个核细胞进行磁分选获得cd4
+
cd25
+
treg细胞，在细胞激活扩增过程中添加细胞因子il-2、anti-cd3/anti-cd28磁珠或单独的anti-cd3、anti-cd28，在treg细胞激活过程或者整个培养过程添加雷帕霉素抑制毒性t淋巴细胞生长。对于treg细胞的冻存，大多采用不同比例的dmso、fbs或人ab血清和培养基混合液作为冻存液冻存treg细胞。
3.在treg培养激活过程中，采用单独的anti-cd3和anti-cd28激活效果往往较差，而采用anti-cd3/anti-cd28的磁珠激活效果较好，但磁珠残留又存在临床安全性问题，在临床应用中需要考虑去除。目前采用的treg细胞冻存液大多是研发级别的，冻存的treg细胞不能直接进行体内回输。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种冻存脐带血treg细胞的体外扩增方法。该方法可稳定扩增纯度高、功能活性好的treg细胞。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种冻存脐带血treg细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
6.(1)复苏冻存脐带血，将融化的脐带血通过ficoll分离方法获得单个核细胞，将单个核细胞进行磁分选获得cd4
+
cd25
+
cd127
low
treg细胞；流式检测cd4
+
cd25
+
treg细胞的比例，若cd4
+
cd25
+
treg细胞比例大于80％则进行下一步实验；
7.(2)treg细胞激活扩增，包括以下步骤：
8.将treg细胞用rpmi-1640培养基以(3-8)
×
105/ml重悬，rpmi-1640培养基添加终浓度为5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2、50-150nm雷帕霉素、10-50μl/ml cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂；
9.培养至第3天，离心收集细胞进行去激活培养，第3天rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
10.第5天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2、50-150nm雷帕霉素；
11.第7天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基rpmi-1640培养基含5％-10％
fbs、200-1000iu/ml il-2；
12.培养第10天，补充新鲜培养基rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
13.第12天离心收集细胞进行重激活培养，第12天的rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2、50-150nm雷帕霉素、10-50μl/ml cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂；
14.第15天离心收集细胞去激活培养，rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
15.分别在17天，19天补充新鲜培养基，rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
16.培养至21天收获细胞，进行treg细胞数量、活力、纯度、细胞杂质残留及淋巴细胞增殖抑制活性检测，如果7-aad-细胞比例大于90％，cd4
+
cd25
+
foxp3
+
treg细胞比例大于80％，cd8
+
t细胞含量低于5％，cd19
+
b细胞低于0.5％，抑制活性大于70％，则进行下一步；如果未达到以上标准，则废弃该批次treg细胞；
17.(3)treg细胞冻存：离心收集treg细胞，计数，用细胞冻存液以5
×
106/ml密度重悬treg细胞，冻存体积为1ml，将细胞悬液移入冻存管后迅速放入程序降温盒置于-80℃冰箱，24h转入液氮保存。
18.按照体积百分比，所述细胞冻存液为70％复方电解质注射液+10％dmso+10％右旋糖酐40氯化钠注射液+10％人血白蛋白静脉输注溶液；其中，复方电解质注射液：每500ml中含氯化钠2.63g,葡萄糖酸钠2.51g,醋酸钠1.84g,氯化钾0.185g,氯化镁0.15g；右旋糖酐40氯化钠注射液：每500ml含30g右旋糖酐40与4.5g氯化钠；人血白蛋白静脉输注溶液：每100ml含有20g人血白蛋白，16mm的n-乙酰色氨酸钠，16mm的辛酸钠，140mm的氯化钠及注射用水。
19.所述细胞冻存液为cs10或亘诺细胞保存液。
20.步骤(1)中冻存脐带血的复苏：将50ml冻存袋冻存的35ml脐带血置于37-42℃的恒温水浴中左右摇动，并不断用手轻轻捻动冷冻袋中冷冻物，直至血液完全融化。
21.步骤(1)中将融化的脐带血移至50ml离心管，用注射用生理盐水稀释6倍，600g，4℃离心30min，收集细胞沉淀；用40ml生理盐水重悬细胞,细胞悬液与ficoll以1:1混合，650g,18℃离心30min，收集脐带血单个核细胞，用生理盐水洗涤2次。
22.步骤(1)中将获得的脐带血单个核细胞计数，用stemcell分选缓冲液以5
×
107/ml的浓度重悬细胞，并通过37μm细胞筛；将细胞悬液转移至圆底流式上样管，加入50μl cd25 positive selection cocktail抗体，混匀后室温孵育5min；加入30μl releasable rapidspheres
tm
和50μl cd4
+
t cell enrichment cocktail，混匀后室温孵育5min；加入分选缓冲液至2.5ml吹打混匀2-3次后放入磁极室温孵育10min；倒掉上清，移除磁极，加入分选缓冲液至2.5ml吹打混匀，置于磁极中室温孵育5min，倒掉上清，再重复此过程2次；移除磁极，加入1ml分选缓冲液重悬细胞，加入100μl release buffer混匀；加入50μl cd127
high depletion cocktail室温孵育5min；加入10μl dextran rapidspheres
tm
室温孵育5min；加分选缓冲液至2.5ml吹打混匀，置于磁极中孵育5min,收集细胞悬液；离心后获得细胞备用。
23.上述冻存脐带血treg细胞的体外扩增方法得到的冻存脐带血treg细胞。
24.本发明的有益效果是：采用冻存脐带血，依托全球存储脐血，资源丰富，可提前制备存储，满足自体与异体应用；在cbmc分离和cd4
+
cd25
+
cd127
low
treg分选基础上，采用结合有anti-cd3、anti-cd28和anti-cd2的可溶性载体(cd3/cd28/cd2 t细胞激活剂)激活treg细胞，增强了treg细胞的激活效果，不存在细胞临床应用的磁珠安全性问题；雷帕霉素一方面具有抑制毒性t淋巴细胞生长的作用，另一方面可以增强treg细胞抑制活性。在treg培养过程中，分别在0-3d、5-7d、12-15d添加雷帕霉素，相对于只在激活过程添加，treg细胞纯度和抑制活性明显提高，相对于在整个培养过程添加，可显著提高treg细胞数量。采用gmp级别的可直接回输的cs10和三生生物的亘诺细胞保存液，能够维持treg细胞的活力、表型及抑制活性。
附图说明
25.图1为本发明实施例1中脐带血treg细胞扩增不同阶段的细胞形态图。
26.图2为本发明实施例1和实施例2中脐带血treg细胞扩增倍数结果图。
27.图3a为本发明实施例1和实施例2中脐带血treg细胞cd4
+
cd25
+
表达分析结果图。
28.图3b为本发明实施例1和实施例2中脐带血treg细胞foxp3
+
表达分析结果图。
29.图4a为本发明实施例1和实施例2中脐带血treg细胞中cd19
+
b细胞残留分析结果图。
30.图4b为本发明实施例1和实施例2中脐带血treg细胞中cd8
+
t细胞残留分析结果图。
31.图5a为本发明实施例1中脐带血treg细胞抑制pbmc增殖的流式分析结果图。
32.图5b为本发明实施例2中脐带血treg细胞抑制pbmc增殖的流式分析结果图。
33.图5c为本发明实施例1和实施例2中脐带血treg细胞抑制pbmc增殖的统计分析差异结果图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。
35.本发明的冻存脐带血treg细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
36.(1)复苏冻存脐带血，将融化的脐带血通过ficoll分离方法获得单个核细胞，将单个核细胞进行磁分选获得cd4
+
cd25
+
cd127
low
treg细胞；流式检测cd4
+
cd25
+
treg细胞的比例，若cd4
+
cd25
+
treg细胞比例大于80％则进行下一步实验；
37.(2)treg细胞激活扩增，包括以下步骤：
38.将treg细胞用rpmi-1640培养基以(3-8)
×
105/ml重悬，rpmi-1640培养基添加终浓度为5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2、50-150nm雷帕霉素、10-50μl/ml cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂；
39.培养至第3天，离心收集细胞进行去激活培养，第3天rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
40.第5天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基rpmi-1640培养基含5％-10％
fbs、200-1000iu/ml il-2、50-150nm雷帕霉素；
41.第7天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
42.培养第10天，补充新鲜培养基rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
43.第12天离心收集细胞进行重激活培养，第12天的rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2、50-150nm雷帕霉素、10-50μl/ml cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂；
44.第15天离心收集细胞去激活培养，rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
45.分别在17天，19天补充新鲜培养基，rpmi-1640培养基含5％-10％fbs、200-1000iu/ml il-2；
46.培养至21天收获细胞，进行treg细胞数量、活力、纯度、细胞杂质残留及淋巴细胞增殖抑制活性检测，如果7-aad-细胞比例大于90％，cd4
+
cd25
+
foxp3
+
treg细胞比例大于80％，cd8
+
t细胞含量低于5％，cd19
+
b细胞低于0.5％，抑制活性大于70％，则进行下一步；如果未达到以上标准，则废弃该批次treg细胞；
47.(3)treg细胞冻存：离心收集treg细胞，计数，用细胞冻存液以5
×
106/ml密度重悬treg细胞，冻存体积为1ml，将细胞悬液移入冻存管后迅速放入程序降温盒置于-80℃冰箱，24h转入液氮保存。
48.按照体积百分比，所述细胞冻存液为70％复方电解质注射液+10％dmso+10％右旋糖酐40氯化钠注射液+10％人血白蛋白静脉输注溶液；其中，复方电解质注射液：每500ml中含氯化钠2.63g,葡萄糖酸钠2.51g,醋酸钠1.84g,氯化钾0.185g,氯化镁0.15g；右旋糖酐40氯化钠注射液：每500ml含30g右旋糖酐40与4.5g氯化钠；人血白蛋白静脉输注溶液：每100ml含有20g人血白蛋白，16mm的n-乙酰色氨酸钠，16mm的辛酸钠，140mm的氯化钠及注射用水。
49.所述细胞冻存液为cs10或亘诺细胞保存液。
50.步骤(1)中冻存脐带血的复苏：将50ml冻存袋冻存的35ml脐带血置于37-42℃的恒温水浴中左右摇动，并不断用手轻轻捻动冷冻袋中冷冻物，直至血液完全融化。
51.步骤(1)中将融化的脐带血移至50ml离心管，用注射用生理盐水稀释6倍，600g，4℃离心30min，收集细胞沉淀；用40ml生理盐水重悬细胞,细胞悬液与ficoll以1:1混合，650g,18℃离心30min，收集脐带血单个核细胞，用生理盐水洗涤2次。
52.步骤(1)中将获得的脐带血单个核细胞计数，用stemcell分选缓冲液以5
×
107/ml的浓度重悬细胞，并通过37μm细胞筛；将细胞悬液转移至圆底流式上样管，加入50μl cd25 positive selection cocktail抗体，混匀后室温孵育5min；加入30μl releasable rapidspheres
tm
和50μl cd4
+
t cell enrichment cocktail，混匀后室温孵育5min；加入分选缓冲液至2.5ml吹打混匀2-3次后放入磁极室温孵育10min；倒掉上清，移除磁极，加入分选缓冲液至2.5ml吹打混匀，置于磁极中室温孵育5min，倒掉上清，再重复此过程2次；移除磁极，加入1ml分选缓冲液重悬细胞，加入100μl release buffer混匀；加入50μl cd127
high depletion cocktail室温孵育5min；加入10μl dextran rapidspheres
tm
室温孵育5min；加
分选缓冲液至2.5ml吹打混匀，置于磁极中孵育5min,收集细胞悬液；离心后获得细胞备用。
53.上述冻存脐带血treg细胞的体外扩增方法得到的冻存脐带血treg细胞。
54.下面实施例中所使用的cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂为immunocult
tm
人cd3/cd28/cd2 t细胞激活剂，来源于stemcell technologies公司，是由可结合并交联cd3,cd28和cd2细胞表面配体的可溶性抗体复合物组成，可为t细胞激活提供所需的初级和共刺激信号。
55.实施例1
56.1)冻存脐带血的复苏：将50ml冻存袋冻存的约35ml脐带血置于37-42℃的恒温水浴中左右摇动，并不断用手轻轻捻动冷冻袋中冷冻物，直至血液完全融化。
57.2)脐带血单个核细胞的分离：将融化的脐带血移至50ml离心管，用注射用生理盐水稀释6倍，600g，4℃离心30min，收集细胞沉淀。用40ml生理盐水重悬细胞,细胞悬液与ficoll以1:1混合，650g,18℃离心30min，收集脐带血单个核细胞，用生理盐水洗涤2次。
58.3)磁珠分选treg细胞：将所述步骤2)中获得的脐带血单个核细胞计数，用stemcell分选缓冲液以5
×
107/ml的浓度重悬细胞，并通过37μm细胞筛；将细胞悬液转移至圆底流式上样管，加入50μl cd25 positive selection cocktail抗体，混匀后室温孵育5min；加入30μl releasable rapidspheres
tm
和50μl cd4
+
t cell enrichment cocktail，混匀后室温孵育5min；加入分选缓冲液至2.5ml吹打混匀2-3次后放入磁极室温孵育10min；倒掉上清，移除磁极，加入分选缓冲液至2.5ml吹打混匀，置于磁极中室温孵育5min，倒掉上清，再重复此过程2次；移除磁极，加入1ml分选缓冲液重悬细胞，加入100μl release buffer混匀；加入50μl cd127
high depletion cocktail室温孵育5min；加入10μl dextran rapidspheres
tm
室温孵育5min；加分选缓冲液至2.5ml吹打混匀，置于磁极中孵育5min,收集细胞悬液；离心后获得细胞备用。
59.4)treg细胞激活扩增：将treg细胞用rpmi-1640培养基以5
×
105/ml重悬，培养基添加终浓度为10％fbs、500iu/ml il-2、100nm雷帕霉素、20μl/ml cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂；培养至第3天，离心收集细胞进行去激活培养，rpmi-1640培养基含10％fbs、500iu/ml il-2；第5天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基rpmi-1640培养基含10％fbs、500iu/ml il-2、100nm雷帕霉素；第7天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基rpmi-1640培养基含10％fbs、500iu/ml il-2；培养第10天，补充新鲜培养基rpmi-1640培养基含10％fbs、500iu/ml il-2；第12天离心收集细胞进行重激活培养，rpmi-1640培养基含10％fbs、500iu/ml il-2、100nm雷帕霉素、20μl/ml cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂；第15天离心收集细胞去激活培养，rpmi-1640培养基含10％fbs、500iu/ml il-2；分别在17天，19天补充新鲜培养基，rpmi-1640培养基含10％fbs、500iu/ml il-2；培养至21天收获细胞，进行treg细胞数量、活力、纯度、细胞杂质残留及淋巴细胞增殖抑制活性检测。
60.5)treg细胞冻存：离心收集treg细胞，计数，选用三种细胞冻存液以5
×
106/ml密度重悬treg细胞，冻存体积为1ml，将细胞悬液移入冻存管后迅速放入程序降温盒置于-80℃冰箱，24h转入液氮保存3个月。(冻存液1：70％复方电解质注射液+10％dmso+10％右旋糖酐40氯化钠注射液+10％人血白蛋白静脉输注溶液冻存液2：cs10(stemcell technology)冻存液3：亘诺细胞保存液(南京三生生物))
61.6)treg细胞复苏：将细胞置于37℃水浴中快速融解，移至15ml离心管，缓慢加入
5ml含0.5％hsa的复方电解质注射液，室温静置5min。颠倒混匀，取100μl细胞悬液进行活力计数；剩余细胞悬液以300g,18℃离心6min,弃上清，用2ml含10％fbs的rpmi-1640培养基重悬，1ml用于流式表型分析，1ml用于淋巴细胞增殖抑制实验。
62.结果显示，本实施例中20μl/ml的cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂，500iu/ml的il-2，100nm的雷帕霉素可明显诱导高纯度的treg细胞增殖。脐带血treg细胞第21天时细胞活力为96.8％，cd4
+
cd25
+
阳性率为97.8％，foxp3
+
阳性率为94.8％，cd8
+
t细胞低于2.5％，cd19
+
b细胞低于0.1％；细胞的扩增倍数为1195倍；抑制pbmc增殖的活性为84.5％。
63.实施例2
64.本实施例脐带血treg细胞诱导扩增方法与实施例1具体步骤基本相同，区别在于步骤4中treg细胞用rpmi-1640培养基以3
×
105/ml密度重悬，添加的激活扩增因子浓度为：fbs浓度为5％，il-2浓度为1000iu/ml,雷帕霉素浓度为50nm,cd3/cd28/cd2可溶性t细胞激活剂为10μl/ml。结果显示，本实施例中treg细胞表型与实施例1相似，脐带血treg细胞第21天时细胞活力为95.6％，cd4
+
cd25
+
阳性率为96.9％，foxp3
+
阳性率为89.1％，cd8
+
t细胞低于5.0％，cd19
+
b细胞低于0.1％；细胞的扩增倍数为816倍；抑制pbmc增殖的活性为63.8％。
65.实验结果见图1-图5c。
66.综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。