一种高效降解草甘膦的人苍白杆菌及其应用

1.本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种高效降解草甘膦的人苍白杆菌及其应用。


背景技术：

2.草甘膦(glyphosate，n-膦酰基甲基甘氨酸)是1971年由美国孟山都公司研制的一种广谱灭生、内吸传导型除草剂。由于其具有高效、低毒、廉价等特点，在农、林、牧业等方面得到广泛的应用。迄今为止，草甘膦已成为世界上应用最广、产量最大、年销售额最高的除草剂品种。由于其长期或不当施用对非靶标生物和环境造成的破坏不容忽视，越来越多的研究表明草甘膦并不是一种环境友好型农药，其对非光合生物具有一定的毒性，其毒性大小受制剂类型、生物种类、环境等多种因素影响。近年来，草甘膦的安全问题已引起人们广泛关注。环境中残留的草甘膦不仅对生态系统造成影响，破坏生态平衡，并能通过食物链的富集进入人体内，进而威胁人类健康。因此，如何去除草甘膦的土壤残留污染已成为当前亟待解决的问题。
3.在自然环境中，尤其是长期施用草甘膦的土壤中，存在种类繁多能耐受或降解草甘膦的菌株，因此，从污染环境中筛选污染物质的微生物降解菌株已逐渐成为微生物资源开发的新手段和新策略。目前，国内外有关微生物降解草甘膦的相关报道越来越多，一些具有降解草甘膦能力的微生物也逐渐被分离和鉴定。中国专利《一株中间苍白杆菌ochrobactrum intermedium 26b及其应用》筛选分离出了一株中间苍白杆菌，具有利用草甘膦以及其代谢中间产物作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，可用于降解草甘膦。
4.但是，微生物降解草甘膦的能力因菌株不同而存在一定的差异性，目前筛选获得的草甘膦降解微生物种类少，效率不高，而且微生物菌存在退化的问题，严重制约了草甘膦降解菌的进一步研究利用。因此，筛选获得多种遗传稳定性好、降解效率高、适应性强的草甘膦降解菌株，不断丰富菌库，是当前亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有草甘膦残留降解修复技术的不足，提供一株新的高效降解草甘膦的微生物菌及降解菌剂和降解方法，可用于快速高效降解草甘膦，修复被草甘膦残留污染的土壤和水体等环境。
6.本发明的第一个目的是提供一株人苍白杆菌a-1。
7.本发明的第二个目的是提供所述人苍白杆菌a-1在降解草甘膦方面的应用。
8.本发明的第三个目的是提供一种可用于降解草甘膦或用于修复草甘膦污染的环境的菌剂。
9.本发明的第四个目的是提供利用人苍白杆菌a-1降解草甘膦或修复其污染环境的方法。
10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
11.本发明首先提供了一株人苍白杆菌(ochrobactrum anthropi)a-1，该菌株已于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc no：61823，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
12.本发明筛选得到了一株可高效快速降解草甘膦的人苍白杆菌a-1，该菌株a-1是从广州市花都区某农药厂废水处理池的活性污泥中经人工富集培养、分离纯化得到，对草甘膦具有高效的降解效能，在以草甘膦为唯一碳源的基础盐培养基中培养36h，对100mg/l草甘膦的降解率达到100％，可耐受800mg/l高浓度的草甘膦。将该菌株a-1接种污染水-沉积物体系(用于模拟草甘膦污染的环境)24h后，水-沉积物体系中草甘膦的残留量降低93％以上，降解能力优异。可见，本发明筛选获得的菌株a-1可高效快速地去除水体和土壤中该类农药的残留量，可以作为优良的生物降解菌应用于草甘膦污染位点的生物修复。
13.进一步地，所述人苍白杆菌a-1或其菌悬液在降解草甘膦中的应用应在本发明的保护范围之内。
14.进一步地，所述人苍白杆菌a-1或其菌悬液在制备降解草甘膦的产品中的应用，也应在本发明的保护范围之内。所述产品可以是含有菌株a-1的菌剂，也可以是含有菌株a-1和常规配方组分的除草剂。
15.进一步地，本发明还提供所述人苍白杆菌a-1或其菌悬液在修复草甘膦污染环境中的应用。
16.优选地，所述环境包括水体和/或土壤。
17.优选地，所述环境包括农业生产区域、工业生产区域、城市绿化区域和住宅区域中的一种或多种环境。
18.进一步地，本发明还提供了一种可用于降解草甘膦的菌剂，包含所述的人苍白杆菌a-1。
19.优选地，为了保证菌株a-1在产业应用中降解草甘膦的速度和效率，所述菌剂中，所述人苍白杆菌a-1的菌体数量不低于1.0
×
105cfu/ml。
20.进一步优选地，所述菌剂中，所述人苍白杆菌a-1的菌体数量为1.0
×
105～1.0
×
109cfu/ml。
21.基于此，利用该菌剂降解草甘膦或修复其污染的环境的方法，也应在本发明的保护范围之内。
22.另外为了达到更好更稳定的降解效果，利用所述菌株a-1降解草甘膦或修复其污染环境的环境条件优选为：温度为20～40℃，更优选25～35℃。
23.进一步地，利用所述菌株a-1降解草甘膦或修复其污染环境的环境条件优选为：ph为5～9，更优选ph为6～7。
24.本发明具有以下有益效果：
25.(1)本发明筛选得到了一株可高效快速降解草甘膦的人苍白杆菌a-1，所述菌株a-1在以草甘膦为唯一碳源的基础盐培养基中培养36h，对100mg/l草甘膦的降解率达到100％，可耐受800mg/l高浓度草甘膦；将该菌株接种污染水-沉积物体系24h后，体系中草甘膦残留量降低93％以上，表明所述菌株a-1不仅可高效快速降解草甘膦，也可用于修复草甘膦污染的水体、土壤等自然环境，可高效快速去除水体和土壤中该类农药的残留量。
26.(2)本发明提供的人苍白杆菌a-1丰富了农药降解菌的种质资源库，在草甘膦残留
污染的水体和土壤生物修复中有重大应用价值，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。
附图说明
27.图1为菌株a-1在lb固体培养基上的菌落形态图。
28.图2为菌株a-1的扫描电镜图。
29.图3为菌株a-1的16s rdna系统进化分析。
30.图4为菌株a-1的生长曲线与草甘膦降解曲线。
31.图5为不同ph条件下，菌株a-1降解草甘膦的降解曲线。
32.图6为不同接种量条件下，菌株a-1降解草甘膦的降解曲线。
33.图7为不同温度条件下，菌株a-1降解草甘膦的降解曲线。
34.图8为不同草甘膦初始浓度条件下，菌株a-1降解草甘膦的降解曲线。
35.图9为菌株a-1对水-沉积物体系中草甘膦的降解图。
具体实施方式
36.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.以下实施例中所述培养基配方如下：
38.基础盐培养基(msm，g/l)：(nh4)2so4，2.0；cacl2·
2h2o，0.01；feso4·
7h2o，0.001；na2hpo4·
12h2o，1.5；mgso4·
7h2o，0.2；kh2po4，1.5。
39.luria-bertani培养基(lb，g/l)：酵母提取物，5.0；蛋白胨，10.0；氯化钠，10.0。
40.种子培养基和发酵培养基的配方与lb培养基一致。
41.以上培养基以蒸馏水配成，ph 7.2，于高压湿热灭菌锅121℃灭菌20分钟。固体培养基：每1l培养基加入15g琼脂粉。
42.实施例1人苍白杆菌(ochrobactrum anthropi)a-1的分离与鉴定
43.1、草甘膦降解菌株的筛选分离
44.采集广州市花都区某农药厂废水处理池的活性污泥，称取5g活性污泥样品加入到50ml含有草甘膦(50mg/l)的上述msm液体培养基中。经30℃，200r/min培养7d后，每次取2％的上一轮培养液接种到新的msm培养基中，将农药质量浓度从50mg/l依次升至100mg/l、200mg/l、400mg/l、800mg/l进行连续富集培养。然后将转接4次的培养液梯度稀释涂布于含有400和800mg/l草甘膦的msm固体平板上，30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落在lb固体培养基上多次划线纯化，随后使用超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)验证其降解效果。
45.最终，分离获得一株高效降解草甘膦的菌株，编号为a-1，并利用20％的甘油将该菌株保存于-80℃。该菌株a-1可以利用草甘膦作为唯一的碳源和能源生长，4天内对草甘膦的降解率达到100％。
46.2、菌株a-1的鉴定
47.(1)形态学鉴定
48.将菌株a-1接种于lb固体平板上30℃倒置培养2d，观察其菌落形态，分析菌株的生
物学特性以及扫描电镜下的形态。
49.菌株a-1在lb固体平板培养2d的菌落形态如图1所示，菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐光滑，菌落表面湿润有光泽、黏稠、中央隆起、不透明。其主要生物学特性为：革兰氏阴性，好氧。
50.菌株a-1的扫描电镜图如图2所示，可以看出，扫描电镜下可以观察到该菌株细胞呈杆状。
51.(2)生理生化鉴定
52.菌株a-1的生理生化特征结果分析如表1所示。菌株a-1为革兰氏阴性细菌，好氧，具运动性，接触酶、氧化酶、v-p测定、硝酸盐还原、七叶苷水解、脲酶反应阳性，明胶液化、吲哚、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应阴性；可利用柠檬酸盐、d-葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、肌醇、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、棉籽糖。
53.表1
[0054][0055][0056]
(3)16s rdna分子生物学鉴定
[0057]
提取菌株a-1基因组dna为模板，采用16s rdna细菌通用引物(27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'；1429r:5'-ggttacctt gttacgactt-3')进行pcr扩增，pcr产物
委托金唯智(广州)生物科技有限公司进行测序。将菌株a-1测得的16s rdna序列在genbank数据库中利用blast进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列，利用clustal-w及mega-x软件构建系统进化树及分析进化关系。
[0058]
菌株a-1的16s rdna系统进化分析结果如图3所示，可以看出，本发明分离纯化得到的菌株a-1的16s rdna序列与苍白杆菌(ochrobactrum sp.)lmg 3301同源性达99％，进化距离最近。因此，结合形态学观察、生理生化鉴定和分子生物学鉴定结果分析，鉴定该菌株属于人苍白杆菌(ochrobactrum anthropi)。
[0059]
基于上述鉴定结果，将该菌株命名为人苍白杆菌(ochrobactrum anthropi)a-1，并于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc no：61823，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0060]
实施例2人苍白杆菌a-1对草甘膦的降解效果实验
[0061]
1、实验方法
[0062]
(1)种子液制备：将实施例1中纯化后的人苍白杆菌a-1接入含有5ml的lb液体培养基中，过夜活化培养至对数期，4000rpm离心后，菌体用无菌生理盐水(0.9％nacl)冲洗两次，所得菌体作为接种体。用无菌生理盐水将菌体重悬，调节菌体od
600
值为1.0。
[0063]
(2)降解性能测定：将上述1ml菌液接种至50ml含有草甘膦(400mg/l)的msm培养液中，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm条件下恒温摇床培养72h，每12h取样一次，利用紫外-可见光分光光度计测定人苍白杆菌a-1的生长情况(od
600
)，并采用超高效液相色谱串联质谱仪(uplc-ms/ms)测定其对草甘膦的降解情况。
[0064]
(3)草甘膦检测条件：
[0065]
uplc-ms/ms：液相系统acquity uplc；
[0066]
质谱系统xevo-tqd(waters,usa)；
[0067]
色谱柱：acquity uplc hss t3，1.7μm，2.1*100mm色谱柱；
[0068]
流速：0.3ml/min；
[0069]
柱温：35℃；
[0070]
进样体积：5μl；
[0071]
流动相：a：水(含2mm乙酸铵+0.1％氨水)b：甲醇；
[0072]
检测时间、流速，以及a、b流动相的检测条件如下表2所示。
[0073]
表2
[0074]
时间(min)流速ab初始0.3099％1％1.500.3099％1％3.500.3010％90％4.000.3010％90％6.000.3099％1％
[0075]
离子源：电喷雾离子化源esi负离子，mrm模式；
[0076]
毛细管电压：3.5kv；
[0077]
源温度：150℃；
[0078]
雾化气温度：350℃；
[0079]
雾化气流速：800l/h。
[0080]
按照下式计算草甘膦降解率：降解率(％)＝(1-a1/a0)
×
100％，a1为降解菌处理后草甘膦残留浓度，a0为对照处理后的草甘膦残留浓度。
[0081]
质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。
[0082]
2、实验结果
[0083]
人苍白杆菌a-1生长与降解草甘膦的动态变化如图4所示，可以看出菌株a-1在12-60h进入对数生长期，菌体快速增长，草甘膦的降解迅速增加；菌株a-1在36h时，降解率达到100％；60h后，菌株a-1开始进入衰亡期。
[0084]
实施例3不同培养条件对人苍白杆菌a-1降解草甘膦的影响
[0085]
1、实验方法
[0086]
实施例1获得的人苍白杆菌a-1于液体lb培养基中活化，在30℃，200r/min恒温摇床中避光培养12h，经8000r/min离心10min后收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次后重悬，调节菌悬液的od
600
值为1.0后备用。分别研究初始ph(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)、接种量(1％、2％、3％、4％和5％)、温度(20℃、25℃、30℃、35℃和40℃)、草甘膦初始浓度(25、50、100、200、400和800mg/l)4个因素对人苍白杆菌a-1降解草甘膦的影响。随后每间隔12h取样检测残余草甘膦的浓度。以不接菌为对照，每个处理设3个重复。通过利用uplc-ms/ms测定培养基中草甘膦的残留，评价不同培养条件对人苍白杆菌a-1降解草甘膦的影响。
[0087]
2、实验结果
[0088]
分别考察了ph、接种量、温度、草甘膦初始浓度的影响。由图5可知，在ph 6～7之间，菌株a-1对草甘膦的降解效率最高，当ph为5时，菌株a-1对草甘膦的降解受到显著的抑制，72h时，降解率为55.4％。同样，当ph达到9时，降解效率也有轻微降低，但依旧在72h内能完全降解草甘膦。
[0089]
接种量对菌株a-1降解草甘膦的影响如图6所示，由图6可知，接种量对菌株a-1对草甘膦的降解率的影响随着接种量的增加而增加，接种量为4％时，降解率最高，在24h时达到94.7％。
[0090]
另外，温度对菌株a-1降解草甘膦的影响结果如图7所示，温度在25～35℃之间，降解效率较高，温度过高或者温度过低均不利于草甘膦的降解。
[0091]
最后，草甘膦初始浓度对菌株a-1降解草甘膦的影响如图8所示，由图8可知，随着草甘膦浓度增加，菌株a-1的降解效率也逐渐下降，说明草甘膦对菌株a-1生长有一定的抑制作用。菌株a-1在草甘膦初始浓度为25～400mg/l之间时，降解效率较高，然而当草甘膦初始浓度为800mg/l时，草甘膦对菌株a-1的毒性较大，降解活性降低。
[0092]
实施例4人苍白杆菌a-1对草甘膦污染水-沉积物体系的修复实验
[0093]
1、供试土样
[0094]
森林表层土(5～20cm)，取自广州市华南农业大学树木园，属红壤土，5年内没有施用草甘膦和其他农药的记录。土壤的理化参数表征为(g/kg，干重)：有机物，10.5；总氮，0.5；总磷，0.4；总钾，18.2；ph值为6.9。土壤由65.0％沙子，28.0％淤泥和7.0％黏土组成。
[0095]
模拟水-沉积物修复体系由10％(w/v)的土壤和90％(v/v)蒸馏水组成。将总体积为50ml的水-沉积物混合物添加到250ml锥形瓶中，并加入一定体积草甘膦，使体系中草甘膦的初始浓度为60mg/l。将实施例1中的人苍白杆菌a-1稀释成菌悬液并且调节菌悬液od
600
值为1.0，再接种于水沉积物修复体系，使接种量为2％，实验样品在转速为200r/min，温度为30℃下避光培养，每隔12h取出混匀的5ml样品用于分析测定草甘膦的残留浓度，对照组为未添加人苍白杆菌a-1的空白组。同时对水-沉积物体系做灭菌和未灭菌处理，所以本试验共4个处理：灭菌体系+未接菌(ss+ck)、灭菌体系+接菌(ss+a-1)、未灭菌体系+未接菌(ns+ck)、未灭菌体系+接菌(ns+a-1)。每个处理设置3个重复。uplc-ms/ms法测定草甘膦的残留量并计算降解率。降解率计算方法同以上实施例3。
[0096]
2、实验结果
[0097]
人苍白杆菌a-1在水-沉积物体系中降解草甘膦的曲线和动力学参数分别如图9和表3所示，从图中可以看出，接种菌株a-1能够显著促进水-沉积物体系中草甘膦的降解，在24h时，菌株a-1分别在灭菌和未灭菌的体系中，对草甘膦降解率分别达到了93.38％和100％。在36h时，菌株a-1在灭菌水-沉积物体系中完全降解草甘膦。另外，在未接种菌株a-1时，水-沉积物中的草甘膦也有一定的降解，灭菌和未灭菌的体系中，在72h分别降解了42.99％和62.11％。说明在水-沉积物中添加人苍白杆菌a-1对草甘膦的降解率要显著高于未添加人苍白杆菌a-1的降解。另外，也说明本研究选择的水-沉积物体系中也存在草甘膦降解土著微生物，对体系中草甘膦的降解发挥着重要的作用。
[0098]
通过一级动力学模型拟合，获得动力学参数如表3所示，从表中可以看出，菌株a-1接种到灭菌水-沉积物体系后的降解过程速率常数(k)为0.07857h-1
，半衰期(t
1/2
)为8.82h，而未接种的灭菌水-沉积物体系中草甘膦的半衰期达到89.79h。在接种菌株a-1的未灭菌水-沉积物体系中，该过程的k值为0.09831h-1
，t
1/2
为7.05h。而灭菌的对照组中，草甘膦的半衰期达到44.18h。以上结果说明，菌株a-1能够在草甘膦污染的水-沉积物体系中能够定殖并稳定生长，发挥生物修复的功效。
[0099]
表3人苍白杆菌a-1在水-沉积物体系中降解草甘膦的动力学参数
[0100][0101][0102]
注：ss表示灭菌的水-沉积物体系，ns表示未灭菌的水-沉积物体系。
[0103]
实施例5人苍白杆菌a-1降解菌剂的制备
[0104]
使用上述人苍白杆菌a-1制备降解菌剂的生产工艺流程为：斜面菌种-摇瓶种子液-种子罐培养-生产罐发酵-降解菌剂(剂型可为悬浮剂或粉剂)。具体方法如下：
[0105]
(1)将实施例1获取的人苍白杆菌a-1在lb固体平板上活化，接种于lb试管斜面上备用。
[0106]
(2)将人苍白杆菌a-1的试管种接种于含250ml lb培养基的1000ml摇瓶中，30℃恒温振荡至对数期，获得的菌液接种于种子罐，种子罐中装有灭菌的种子培养基，装液量为70％。将培养好的摇瓶菌液按10％的接种量接种于装液量为70％的种子罐中，无菌空气的通气量为0.8m3/min，搅拌速度为210rpm，培养至对数生长期备用。
[0107]
(3)将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产发酵罐(装液量为70％)发酵培养。投料后的生产罐，在1.1kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.8m3/min，搅拌速度为210r/min，培养温度控制为30℃，整个工艺培养流程时间为36小时，发酵结束后菌体数量≥1.0
×
105cfu/ml，发酵完成后，培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。
[0108]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。