具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途的制作方法

具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途
1.本技术是申请日为2016年11月28日的中国专利申请201680068970.2“具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途”的分案申请。
2.关于以电子方式提交的序列表
3.与本说明书一起以计算机可读形式提交的序列表，其文件名为“5409wopct_sequencelisting.txt”，创建于2015年9月24日，并且大小为267千字节。该序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用结合在此。
技术领域
4.本披露涉及编码杀有害生物多肽的重组核酸，该杀有害生物多肽具有针对玉米穗蛾和/或秋粘虫的杀昆虫活性和/或针对昆虫有害生物的改进的杀有害生物活性谱。本披露的组合物和方法利用所披露的核酸及其编码的杀有害生物多肽以控制植物有害生物。


背景技术：

5.昆虫有害生物是全世界农作物损失中的一个主要因素。例如，粘虫摄食、黑色地老虎损害或欧洲玉米螟损害对农业生产者来说是经济上毁灭性的。仅欧洲玉米螟对田间和甜玉米的攻击造成的昆虫有害生物相关的作物损失就已经达到每年约十亿美元的损失和控制费用。
6.传统上，影响昆虫有害生物种群的主要方法是应用广谱化学杀昆虫剂。然而，消费者和政府监管者同样地变得越来越关注与合成化学杀有害生物剂的生产和使用相关的环境危害。由于这样的关注，监管者已经禁止或限制使用一些更危险的杀有害生物剂。因此，对开发替代性杀有害生物剂有很大的兴趣。
7.使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物控制，为合成化学杀有害生物剂提供环境友好且商业上有吸引力的替代品。一般来说，使用生物杀有害生物剂呈现更低的污染和环境危害的风险，并且生物杀有害生物剂提供比传统广谱化学杀昆虫剂特征更大的靶标特异性。另外，生物杀有害生物剂通常生产成本更低，并且因而提高多种作物的经济产量。
8.已知芽孢杆菌(bacillus)属的微生物的某些物种针对广泛的昆虫有害生物(包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目等)具有杀有害生物活性。苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)和日本金龟子芽孢杆菌是迄今发现的最成功的生物控制剂。昆虫致病性也已归因于幼虫芽胞杆菌(b.larvae)、缓死芽胞杆菌(b.lentimorbus)、球形芽胞杆菌(b.sphaericus)(harwook，编辑，((1989)芽孢杆菌(bacillus)(普林汉诺出版公司(plenum press))，306)和蜡样芽孢杆菌(b.cereus)(wo 96/10083)的菌株。尽管杀有害生物蛋白也已经从芽孢杆菌属的营养生长阶段中分离出来，但是杀有害生物活性似乎集中在伴孢结晶蛋白包含体中。已经分离和表征了编码这些杀有害生物蛋白的若干种基因(参见例如美国专利号5,366,892和5,840,868)。
9.微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的杀昆虫剂，作为化学有害生物
控制的替代品在农业上起着重要的作用。最近，通过对作物植物进行基因工程以产生来自芽孢杆菌属的杀有害生物蛋白，农业科学家已经开发了具有增强的昆虫抗性的作物植物。例如，玉米和棉花植物已被基因工程化以产生从bt株分离的杀有害生物蛋白(参见，例如阿伦森(aronson)(2002)细胞与分子生命科学(cell mol.life sci.)59(3)：417-425；施内普夫(schnepf)等人(1998)微生物学与分子生物学评论(microbiol mol biol rev.)62(3)：775-806)。这些基因工程化的作物现在广泛应用于美国农业，并且为农民提供了传统昆虫控制方法的环境友好的替代品。另外，经过基因工程化以包含杀有害生物的cry毒素的马铃薯已经向美国农民出售。虽然它们已被证明在商业上非常成功，但是这些基因工程化的、抗昆虫的作物植物仅对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物产生抗性。
10.因此，仍然需要具有改进的针对昆虫有害生物的杀昆虫活性谱的新的bt毒素，例如针对来自目鳞翅目和/或鞘翅目的昆虫有改进的活性的毒素。另外，仍然需要对各种昆虫有害生物具有活性的生物杀有害生物剂以及具有改进的杀昆虫活性的生物杀有害生物剂。


技术实现要素：

11.提供了用于影响昆虫有害生物的组合物和方法。更具体地，本披露的实施例涉及利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列以产生转化的微生物和表达这些实施例的杀昆虫多肽的植物来影响昆虫的方法。在一些实施例中，这些核苷酸序列编码如下多肽，该多肽为属于目鳞翅目的至少一种昆虫的杀有害生物剂。
12.在一些方面，提供了核酸分子及其片段和变体，其编码针对昆虫有害生物具有杀有害生物活性的多肽(例如seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18、seq id no：20、seq id no：22、seq id no：24、seq id no：26、seq id no：28、seq id no：30、seq id no：32、seq id no：34、seq id no：36、seq id no：38、seq id no：40、seq id no：42、seq id no：44、和seq id no：46，并且分别编码多肽seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：27、seq id no：29、seq id no：31、seq id no：33、seq id no：35、seq id no：37、seq id no：39、seq id no：41、seq id no：43或seq id no：45)。从bt获得的实施例的野生型(例如天然存在的)核苷酸序列编码杀昆虫肽。实施例进一步提供编码生物活性的(例如杀昆虫的)多肽的所披露的核苷酸序列的片段和变体。
13.在另一个方面，提供了变体cry1b多肽，这些变体cry1b多肽由实施例的经修饰(例如，诱变或操作的)核酸分子编码。在具体实例中，实施例的杀有害生物蛋白包括由设计用于将特定氨基酸序列引入实施例的多肽的诱变核酸产生的全长蛋白质和多肽的片段。在具体实施例中，相对于衍生自其的天然存在的多肽的活性，多肽具有增强的杀有害生物活性。
14.在另一个方面，实施例的核酸还可以用于产生转基因(例如，转化的)单子叶植物或双子叶植物，这些单子叶植物或双子叶植物的特征在于包含至少一个稳定掺入的核苷酸构建体的基因组，该核苷酸构建体包含可操作地连接到驱动编码的杀有害生物多肽的表达的启动子。因此，也提供了转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。
15.在另一个方面，转化的植物可以使用已经被优化以在宿主植物中增加表达的核酸来产生。例如，可以将实施例的杀有害生物多肽之一反向翻译以产生如下核酸，该核酸包含
针对在特定宿主例如作物植物像玉米(玉蜀黍(zea mays))中表达而优化的密码子。通过这样的转化的植物(例如双子叶植物或单子叶植物)的编码序列的表达将导致杀有害生物多肽的产生并赋予植物增加的昆虫抗性。一些实施例提供表达杀有害生物多肽的转基因植物，这些转基因植物可应用于影响各种昆虫有害生物的方法中。
16.在另一个方面，提供了含有实施例的变体cry1b多肽的杀有害生物或杀昆虫组合物，并且该组合物可以任选地包含其他杀昆虫肽。这些实施例涵盖将这些组合物应用于昆虫有害生物的环境以便影响昆虫有害生物。
附图说明
17.图1a-1g显示了使用vector套件的模块，cry1bd(seq id no：1)、ip1b-b1(seq id no：3)、ip1b-b21(seq id no：5)、ip1b-b22(seq id no：7)、ip1b-b23(seq id no：9)、ip1b-b24(seq id no：11)、ip1b-b25(seq id no：13)、ip1b-b26(seq id no：15)、ip1b-b27(seq id no：17)、ip1b-b28(seq id no：19)、ip1b-b29(seq id no：21)、ip1b-b31(seq id no：23)、ip1b-b32(seq id no：25)、ip1b-b33(seq id no：27)、ip1b-b34(seq id no：29)、ip1b-b40(seq id no：31)、ip1b-b41(seq id no：33)、ip1b-b42(seq id no：35)、ip1b-b43(seq id no：37)、ip1b-b44(seq id no：39)、ip1b-b45(seq id no：41)、ip1b-b46(seq id no：43)、ip1b-b47(seq id no：45)、mp258(seq id no：47)、和gs060(seq id no：49)的氨基酸序列比对。突出显示了cry1b多肽之间的氨基酸序列多样性。
18.图2a-2e显示了mp258的氨基酸序列，其中前导区(*)、结构域i(#)、结构域ii(&)、和结构域iii(！)在序列下指出。
19.图3显示使用vector套件的模块，cry1be的cry1be型结构域i(seq id no：58的氨基酸35-276)和mp258的cry1be型结构域i(seq id no：47的氨基酸36-276)的氨基酸序列比对。突出显示了cry1b多肽的结构域i之间的氨基酸序列多样性。
20.图4显示使用vector套件的模块，cry1ah(seq id no：61)、cry1bd、cry1bh(seq id no：52)、cry1bi(seq id no：54)和mp258(seq id no：47)的结构域iii的氨基酸序列比对。突变显示了cry1b多肽的结构域iii之间的氨基酸序列多样性。
21.图5a-5c显示了使用vector套件的莫块，mp258(seq id no：47)、cry1be(seq id no：58)、cry1bi(seq id no：54)、cry1bg(seq id no：60)、cry1bf(seq id no：59)、cry1ba(seq id no：55)、cry1bh(seq id no：52)、cry1bd(seq id no：1)、cry1bb(seq id no：56)、和cry1bc(seq id no：57)的结构域i和结构域ii的氨基酸序列比对。突出显示了cry1b多肽的结构域i和结构域ii之间的氨基酸序列多样性。
具体实施方式
22.本披露的实施例涉及用于影响昆虫有害生物，特别是植物有害生物的组合物和方法。更具体地，实施例的分离的核酸及其片段和变体包含编码杀有害生物多肽(例如蛋白质)的核苷酸序列。所披露的杀有害生物蛋白是针对昆虫有害生物(例如但不限于目鳞翅目和/或鞘翅目的昆虫有害生物)具有生物活性的(例如杀有害生物的)。
23.实施例的组合物包含编码杀有害生物多肽的分离的核酸及其片段和变体、包含实
施例的核苷酸序列的表达盒、分离的杀有害生物蛋白和杀有害生物组合物。一些实施例提供了相对于相应的野生型蛋白质的杀有害生物活性，具有改进的针对鳞翅目的杀昆虫活性的经修饰的杀有害生物多肽。实施例进一步提供了用这些新颖核酸转化的植物和微生物，以及涉及使用这样的核酸、杀有害生物组合物、转化的生物体及其产物来影响昆虫有害生物的方法。
24.实施例的核酸和核苷酸序列可以用于转化任何生物体，以产生编码的杀有害生物蛋白。提供了涉及使用这样的转化的生物体来影响或控制植物有害生物的方法。实施例的核酸和核苷酸序列也可用于转化细胞器例如叶绿体(麦克布赖德(mcbride)等人(1995)生物技术(biotechnology)13：362-365；以及哥打(kota)等人(1999)美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)96：1840-1845)。
25.实施例进一步涉及编码生物活性的杀有害生物蛋白的天然存在的编码序列的片段和变体的鉴定。实施例的核苷酸序列可直接应用于影响有害生物，特别是昆虫有害生物例如鳞翅目有害生物的方法中。因此，实施例提供了不依赖于使用传统的合成化学杀昆虫剂而用于影响昆虫有害生物的新方法。实施例涉及天然存在的可生物降解的杀有害生物剂和编码它们的基因的发现。
26.实施例进一步提供也编码生物活性的(例如杀有害生物的)多肽的天然存在的编码序列的片段和变体。实施例的核酸涵盖已经针对通过特定生物体的细胞的表达而优化的核酸或核苷酸序列，例如基于具有增强的杀有害生物活性的多肽的氨基酸序列使用植物优选的密码子进行反向翻译(即回向翻译)的核酸序列。实施例进一步提供对实施例的多肽赋予改进或改变的性质的突变。参见，例如美国专利7,462,760。
27.在以下描述中，广泛地使用了大量术语。提供以下定义以帮助理解这些实施例。
28.单位、前缀和符号可以按它们si接受的形式来表示。除非另外说明，分别以5
′
至3
′
的方向从左至右来书写核酸；以氨基至羧基的方向从左至右来书写氨基酸序列。数值范围包括限定该范围的数值。本文氨基酸可以通过它们普遍已知的三个字母符号或通过iupac-iub生物化学术语委员会推荐的一个字母符号来表示。同样核酸可以通过它们普遍接受的单一字母代码来表示。以上定义的术语总体上参照说明书而更完整地定义。
29.如本文使用的，“核酸”包括提及处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，涵盖由于以与天然存在的核苷酸相似的方式杂交至单链核酸而具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如肽核酸)。
30.如本文使用的，当在指定核酸的上下文中使用时，术语“编码”(encoding)或“编码的”(encoded)意指核酸包含将核苷酸序列直接转换为指定蛋白质的必要信息。通过使用密码子来详细说明用来编码蛋白质的信息。一种编码蛋白质的核酸在该核酸的翻译区之内可以包括非翻译序列(例如内含子)或可以缺乏此类插入的非翻译序列(例如在cdna中)。
31.如本文使用的，提及特定多核苷酸或其编码蛋白的“全长序列”意指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码特定蛋白质的全长、催化活性形式。
32.如本文使用的，在核苷酸序列方向的上下文中使用的术语“反义”是指以反义链转录的方向可操作地连接至启动子的双链多核苷酸序列。反义链与内源转录产物充分互补，这样使得内源性转录产物的翻译经常被抑制。因此，在特定核苷酸序列的上下文中使用术
语“反义”的情况下，该术语是指参比转录产物的互补链。
33.术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然发生的氨基酸以及天然发生的氨基酸聚合物的一种人工化学类似物。
34.术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在此可互换使用，是指并入蛋白质、多肽或肽(共同称为“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸并且，除非另外限制，否则可以涵盖能以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的天然氨基酸的已知类似物。
35.实施例的多肽可以从本文披露的核酸或通过使用标准分子生物学技术来产生。例如，实施例的蛋白可以通过在适当的宿主细胞中表达实施例的重组核酸或可替代地通过组合体外程序来产生。
36.如本文使用的，术语“分离的”和“纯化的”可互换地使用，是指核酸或多肽或其生物学活性部分实质上或基本上不含如在其天然存在的环境中发现的通常伴随该核酸或多肽或与其互相作用的组分。因此，分离的或纯化的核酸或多肽实质上不含其他细胞物质或当通过重组技术产生时的培养基，或当为化学合成时实质上不含化学前体或其他化学品。
[0037]“分离的”核酸一般不含在衍生该核酸的生物体的基因组dna中自然位于该核酸侧翼的序列(即位于该核酸5
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和3
′
端的序列)(例如像蛋白质编码序列)。例如，在各种实施例中，分离的核酸可以包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些序列在衍生该核酸的细胞的基因组dna中自然位于该核酸侧翼。
[0038]
如本文使用的，术语“分离的”或“纯化的”，如其用于提及实施例的多肽，意指分离的蛋白质实质上不含细胞材料并且包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)污染蛋白质的蛋白质的制剂。当重组生产实施例的蛋白质或其生物活性部分时，培养基含有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或非目标蛋白质化学品。
[0039]
本文使用的“重组”核酸分子(或dna)是指在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或dna)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸是不含有在衍生出该核酸的生物体的基因组dna中天然地位于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5
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和3
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末端的序列)(优选编码蛋白质的序列)。出于本披露的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时排除分离的染色体。
[0040]
如本文使用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”是指与天然或基因组核酸序列相比，核酸序列具有一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的变化包括但不限于：由于遗传密码的简并性引起的核酸序列的变化；用于在植物中表达的核酸序列的密码子优化；与天然或基因组序列相比，在核酸序列中引入至少一个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的变化；去除与基因组核酸序列相关的一个或多个内含子；插入一个或多个异源内含子；缺失与基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与基因组核酸序列相关的5
′
和/或3
′
非翻译区；插入异源5
′
和/或3
′
非翻译区；和多聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，该非基因组核酸分子是edna。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成核酸序列。
[0041]
贯穿本说明书，词语“包括(comprising)”或变体例如“包括”(comprises或comprising)将被理解成暗示含有一种阐明的要素、整体或步骤，或者多个要素、整体或步
骤的组，但是不排除任何其他的要素、整体或步骤，或者多个要素、整体或步骤的组。
[0042]
如本文使用的，术语“影响昆虫有害生物”是指在任何发育阶段影响昆虫摄食、生长和/或行为的变化，包括但不限于：杀死昆虫；延缓生长；阻止生殖能力；拒摄食活动；等等。
[0043]
如本文使用的，术语“杀有害生物活性”和“杀昆虫活性”同义地用于指生物体或物质(例如，像蛋白质)的活性，该活性可以通过但不限于有害生物死亡率、有害生物重量损失、有害生物抵抗性、以及摄食和暴露适当时长后有害生物的其他行为和物理变化来度量。因此，具有杀有害生物活性的生物体或物质不利地影响有害生物适应度的至少一个可测量的参数。例如，“杀有害生物蛋白”是自身或与其他蛋白质组合显示杀有害生物活性的蛋白质。
[0044]
如本文使用的，术语“杀有害生物有效量”意指当存在于有害生物环境中时具有杀有害生物活性的物质或生物体的量。对于每种物质或生物体，针对在特定环境中受影响的每种有害生物，根据经验确定杀有害生物有效量。类似地，当有害生物是昆虫有害生物时，可以使用“杀昆虫有效量”来表示“杀有害生物有效量”。
[0045]
如本文使用的，术语“重组工程化”或“工程化”意指基于对蛋白质作用机制的理解和考虑被引入、缺失或取代的氨基酸，利用重组dna技术来引入(例如，工程化)蛋白质结构的变化。
[0046]
如本文使用的，术语“突变体核苷酸序列”或“突变”或“诱变的核苷酸序列”意指已经被诱变或改变以包含不存在于相应的野生型序列中的一个或多个核苷酸残基(例如，碱基对)的核苷酸序列。这样的诱变或改变由核酸残基的一个或多个添加、缺失、取代或取代组成。当通过添加、除去或替换蛋白水解位点的氨基酸来进行突变时，只要实现突变的目的(即只要位点处的蛋白质水解发生变化)，这样的添加、去除或替换可以在蛋白水解位点基序内或邻近处。
[0047]
突变体核苷酸序列可以编码显示改进或降低的杀昆虫活性的突变型杀昆虫毒素，或编码赋予含有其的多肽改进或降低的杀昆虫活性的氨基酸序列。如本文使用的，在蛋白质或多肽或氨基酸序列的上下文中的术语“突变体”或“突变”是指已经被诱变或改变以包含不存在于相应的野生型序列中的一个或多个氨基酸残基的序列。这样的诱变或改变由氨基酸残基的一个或多个添加、缺失、或取代或替换组成。突变体多肽显示出改进的或降低的杀昆虫活性，或表示赋予含有其的多肽改进的杀昆虫活性的氨基酸序列。因此，术语“突变体”或“突变”是指突变体核苷酸序列和编码的氨基酸中的一个或两者。突变体可以单独使用或与实施例的其他突变体或与其他突变体以任何相容的组合使用。“突变体多肽”可能相反地显示出杀昆虫活性的降低。在向特定核酸或蛋白质中添加多于一个突变的情况下，可以同时或依次添加突变；如果顺序地，能以任何合适的顺序添加突变。
[0048]
如本文使用的，术语“改进的杀昆虫活性”或“改进的杀有害生物活性”是指相对于其相应的野生型蛋白的活性具有增强的杀昆虫活性的实施例的杀昆虫多肽，和/或针对更广泛的昆虫有效的杀昆虫多肽，和/或对对于野生型蛋白质的毒性不敏感的昆虫具有特异性的杀昆虫多肽。改进或增强的杀有害生物活性的发现需要证明针对昆虫靶标至少10％的杀有害生物活性的增加，或相对于针对相同昆虫确定的野生型杀昆虫多肽的杀有害生物活性至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％或300％或
更高的杀有害生物活性的增加。
[0049]
例如，提供了改进的杀有害生物或杀昆虫活性，其中相对于受野生型bt毒素影响的昆虫的范围，更大或更窄范围的昆虫受该多肽的影响。在希望多功能性的情况下，可能希望更广范围的影响，而在例如有益的昆虫否则可能受到毒素的使用或存在的影响的情况下，可能希望更窄范围的影响。虽然实施例不受任何特定的作用机制的约束，但也可以通过多肽的一个或多个特征的改变来提供改进的杀有害生物活性；例如，相对于相应的野生型蛋白质的稳定性或寿命，昆虫肠中多肽的稳定性或寿命可以增加。
[0050]
如本文使用的，术语“毒素”是指显示杀有害生物活性或杀昆虫活性或改进的杀有害生物活性或改进的杀昆虫活性的多肽。“bt”或“苏云金芽孢杆菌”毒素旨在包括在各种bt菌株中发现的更广泛类型的cry毒素，其包括诸如cry1s、cry2s或cry3s的毒素。
[0051]
术语“蛋白水解位点”或“切割位点”是指赋予对一类蛋白酶或特定蛋白酶敏感性的氨基酸序列，这样使得含有氨基酸序列的多肽被该类蛋白酶或特定蛋白酶消化。认为蛋白水解位点对识别该位点的一个或多个蛋白酶“敏感”。在本领域中应当理解，消化的效率将变化，并且消化效率的降低可以导致多肽在昆虫肠中的稳定性或寿命的增加。因此，蛋白水解位点可以赋予多于一种蛋白酶或一类蛋白酶敏感性，但是各种蛋白酶在该位点处消化的效率可能不同。蛋白水解位点包括例如胰蛋白酶位点、胰凝乳蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。
[0052]
研究已经表明，鳞翅目的昆虫肠蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。参见，例如伦茨(lenz)等人(1991)昆虫生物化学与生理学档案(arch.insect biochem.physiol.)16：201-212；以及hedegus等人(2003)昆虫生物化学与生理学档案(arch.insect biochem.physiol.)53：30-47。例如，在棉铃虫(helicoverpa armigera)幼虫的中肠中已经发现了约18种不同的胰蛋白酶(参见盖特豪斯(gatehouse)等人(1997)昆虫生物化学与分子生物学(insect biochem.mol.biol.)27：929-944)。已经研究了这些蛋白酶的优选蛋白水解底物位点。参见，例如彼得森(peterson)等人(1995)昆虫生物化学与分子生物学(insect biochem.mol.biol.)25：765-774。
[0053]
已经进行努力来了解bt毒素的作用机制并且使用改进的性能来工程化毒素。已经表明，昆虫肠蛋白酶可以影响bt cry蛋白质对昆虫的影响。一些蛋白酶通过将它们从“原毒素”形式加工成毒性形式或“毒素”来活化cry蛋白质。参见，奥波尔特(oppert)(1999)昆虫生物化学与生理学档案(arch.insect biochem.phys.)42：1-12；以及卡罗尔(carroll)等人(1997)无脊椎动物病理学杂志(j.invertebrate pathology)70：41-49。毒素的这种活化可以包括从蛋白质中除去n-和c-末端肽，并且还可以包括蛋白质的内部切割。其他蛋白酶可以降解cry蛋白质。参见奥波尔特(oppert)，同上。
[0054]
不同特异性的cry毒素的氨基酸序列的比较揭示出五个高度保守的序列块。在结构上，毒素包括三个不同的结构域，从n-到c-末端它们是：涉及孔形成的七个α螺旋的簇(称为“结构域i”)、涉及细胞结合的三个反平行β片层(称为“结构域2”)以及β夹心(称为“结构域3”)。这些结构域的位置和属性是本领域技术人员已知的。参见，例如李(li)等人(1991)自然(nature)，305：815-821以及摩尔斯(morse)等人(2001)结构(structure)，9：409-417。当提及特定的结构域例如结构域i时，应当理解，关于特定序列结构域的确切端点不是关键的，只要其序列或部分包括提供至少一些归因于特定的结构域的功能的序列。因此，例如，
当提及“结构域i”时，旨在特定序列包括七个α-螺旋的簇，但是关于该簇使用或引用的序列的确切端点不是关键的。本领域技术人员熟悉此类端点的确定和此类功能的评估。
[0055]
为了改进cry2b毒素，试图努力以鉴定编码来自所选菌株的晶体蛋白的核苷酸序列，该序列与天然毒素相比具有改进的活性。取决于给定制剂的特征，认识到杀有害生物活性的证明有时需要胰蛋白酶预处理来活化杀有害生物蛋白。因此，应当理解，一些杀有害生物蛋白需要蛋白酶消化(例如，通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及类似物)进行活化，而其他蛋白质在没有活化的情况下是具有生物活性的(例如杀有害生物的)。
[0056]
这样的分子可以通过例如美国专利7,462,760所述的方法进行改变。另外，核酸序列可以被工程化以编码含有另外的突变的多肽，这些突变相对于天然存在的多肽的杀有害生物活性赋予改进或改变的杀有害生物活性。此类工程化的核酸的核苷酸序列包括在野生型序列中未发现的突变。
[0057]
实施例的突变体多肽一般通过涉及以下步骤的方法制备：获得编码cry家族多肽的核酸序列；基于在毒素作用模式中提出的靶结构域功能的考虑，分析多肽的结构以鉴定潜在基因序列的诱变的特定“靶”位点；将一个或多个突变引入该核酸序列以在编码的多肽序列的一个或多个氨基酸残基中产生所需的变化；并测定产生的多肽的杀有害生物活性。
[0058]
许多bt杀昆虫毒素通过其氨基酸序列和三级结构的相似性以各种程度相关，并且获得bt毒素的晶体结构的方法是熟知的。cry3a和cry3b多肽两者的示例性高分辨率晶体结构解析可在文献中获得。cry3a的经解析的结构(李(li)等人(1991)自然(nature)353：815-821)提供了对毒素的结构和功能之间关系的见解。对bt毒素的公开的结构分析和与特定结构、基序等相关的报道的功能的综合考虑表明毒素的特定区域与蛋白质的作用模式的特定功能和离散步骤相关。例如，从bt分离的许多毒素通常被描述为包括三个结构域：涉及孔形成的七螺旋束、与受体结合相关的三片层结构域、以及β-夹心基序(李(li)等人(1991)自然(nature)305：815-821)。
[0059]
如美国专利号7,105,332和7,462,760中所报道的，通过靶向位于毒素的结构域i的α螺旋3和4之间的区域可以改进cry蛋白的毒性。这一理论的前提是关于杀昆虫毒素的知识体系，包括：1)已经报道cry3a毒素的结构域i的α螺旋4和5插入到易感昆虫中肠内的细胞的脂双层中(加齐特(gazit)等人(1998)美国国家科学院院刊95：12289-12294)；2)本发明人了解野生型蛋白质的氨基酸序列内的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位点的位置；3)观察到通过胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理体外活化后，野生型蛋白质对某些昆虫更有活性；以及4)报道来自3
′
末端的毒素消化导致对昆虫的毒性降低。
[0060]
可以产生一系列突变并且置于各种背景序列中以产生具有增强或改变的杀有害生物活性的新颖多肽。参见，例如美国专利7,462,760。这些突变体包括但不限于：在位于结构域i的螺旋3和4之间的区域中添加至少一个或多个蛋白酶敏感位点(例如胰蛋白酶切割位点)；用不同的蛋白酶敏感位点替换野生型序列中的原始蛋白酶敏感位点；在特定位置添加多个蛋白酶敏感位点；在一个或多个蛋白酶敏感位点附近添加多个氨基酸残基以改变多肽的折叠，从而增强多肽在一个或多个蛋白酶敏感位点的消化；并且添加突变以保护多肽免于降低毒性的降解性消化(例如，进行一系列突变，其中野生型氨基酸被缬氨酸替换以保护多肽免于消化)。突变可以单独使用或以任何组合使用以提供实施例的多肽。
[0061]
使用blast和psi-blast，通过美国国家生物信息学信息中心(ncbi)的非冗余数据
库(nr)上的相似性检索来鉴定同源性序列。同源性蛋白质主要由苏云金芽孢杆菌的cry毒素构成。
[0062]
作为另外的或替代性蛋白酶敏感位点的突变可能对几类蛋白酶例如丝氨酸蛋白酶(包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)、或酶例如弹性蛋白酶敏感。因此，可以设计作为另外的或替代性蛋白酶敏感位点的突变以便该位点容易被一类蛋白酶(例如哺乳动物蛋白酶或昆虫蛋白酶)识别和/或切割。也可设计蛋白酶敏感位点以被特定类别的酶或已知在生物体中产生的特定酶例如像由玉米穗蛾(heliothis zea)产生的胰凝乳蛋白酶切割(伦茨(lenz)等人(1991)昆虫生物化学和生理学档案(arch.insect biochem.physiol.)16：201-212)。突变还可以赋予对蛋白水解消化的抗性，例如，对在肽的c末端被胰凝乳蛋白酶消化的抗性。
[0063]
在编码的多肽的氨基酸序列中存在另外的和/或替代性蛋白酶敏感位点可以改进由实施例的核酸编码的多肽的杀有害生物活性和/或特异性。因此，与未修饰的野生型毒素相比，实施例的核苷酸序列可以被重组工程化或操作以产生具有改进的或改变的杀昆虫活性和/或特异性的多肽。另外，本文披露的突变可以放置于其他核苷酸序列中或与其他核苷酸序列结合使用，以提供改进的特性。例如，易被昆虫胰凝乳蛋白酶切割的蛋白酶敏感位点，例如，在披肩粘虫(bertha armyworm)或玉米穗蛾中发现的胰凝乳蛋白酶(埃热迪(hegedus)等人(2003)昆虫生物化学和生理学档案(arch.insect biochem.physiol.)53：30-47；以及伦茨(lenz)等人(1991)昆虫生物化学和生理学档案(arch.insect biochem.physiol.)16：201-212)可以放置于cry背景序列中以对该序列提供改进的毒性。以这种方式，实施例提供具有改进的特性的毒性多肽。
[0064]
例如，诱变的cry核苷酸序列可以包含另外的突变体，该突变体包含将第二胰蛋白酶敏感性氨基酸序列(除天然存在的胰蛋白酶位点之外)引入编码的多肽中的另外的密码子。实施例的替代性添加突变体包括另外的密码子，这些密码子被设计用于将至少一个另外的不同的蛋白酶敏感位点引入多肽，例如直接位于天然存在的胰蛋白酶位点的5
′
或3
′
的胰凝乳蛋白酶敏感位点。可替代地，可以产生取代突变体，其中编码天然存在的蛋白酶敏感位点的核酸的至少一个密码子被破坏，并且将替代性密码子引入到核酸序列中以便提供不同的(例如，取代)蛋白酶敏感位点。也可以将替换突变体添加到cry序列中，其中存在于编码的多肽中的天然存在的胰蛋白酶切割位点被破坏，并且在其位置引入胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶切割位点。
[0065]
已经认识到，可以使用编码作为蛋白水解位点或推定的蛋白水解位点的氨基酸序列(例如，诸如rr或lkm的序列)的任何核苷酸序列，并且用于将这些切割位点中任一种引入变体多肽的密码子的确切同一性可以取决于用途(即在特定植物物种中的表达)而变化。还应认识到，任何所披露的突变都可以被引入到实施例的任何多核苷酸序列中，该多核苷酸序列包含提供修饰靶向的天然胰蛋白酶切割位点的氨基酸残基的密码子。因此，全长毒素或其片段的变体可以被修饰以包含另外的或替代性切割位点，并且这些实施例旨在被本文披露的实施例的范围所涵盖。
[0066]
本领域技术人员将理解，只要编码的多肽保留杀有害生物活性，就可以向实施例的序列中添加任何有用的突变。因此，序列也可以被突变以便编码的多肽对胰凝乳蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。能以任何组合的方式将多于一个识别位点添加到特定位置，并
且可以将多个识别位点添加到毒素中或从毒素中除去。因此，另外的突变可以包含三个、四个或更多个识别位点。应当认识到，可以在任何合适的多核苷酸序列中工程化多个突变；因此，可以修饰全长序列或其片段以包含另外的或替代性切割位点并且使得对蛋白水解消化具有抗性。以这种方式，实施例提供了含有改进杀有害生物活性的突变的cry毒素以及使用其他bt毒素影响有害生物的改进的组合物和方法。
[0067]
突变可以保护多肽免受蛋白酶降解，例如通过从不同的区域除去推定的蛋白水解位点，例如推定的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点。此类推定的位点中一些或全部可以被除去或改变，以便降低在原始位点位置处的蛋白水解。可以通过将突变体多肽与野生型毒素进行比较或通过比较氨基酸序列不同的突变体毒素来评估蛋白水解的变化。推定的蛋白水解位点和蛋白水解位点包括但不限于以下序列：rr，胰蛋白酶切割位点；lkm，胰凝乳蛋白酶位点；以及胰蛋白酶位点。只要多肽的杀有害生物活性增加，可以通过添加或缺失任何数量和种类的氨基酸残基来改变这些位点。因此，由包含突变的核苷酸序列编码的多肽将相对于天然或背景序列包括至少一个氨基酸改变或添加，或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、或280或更多个氨基酸改变或添加。如本领域已知的，多肽的杀有害生物活性也可以通过截短天然或全长序列来改进。
[0068]
实施例的组合物包括编码杀有害生物多肽的核酸及其片段和变体。具体地，实施例提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含编码seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：27、seq id no：29、seq id no：31、seq id no：33、seq id no：35、seq id no：37、seq id no：39、seq id no：41、seq id no：43和seq id no：45的氨基酸序列的核苷酸序列，或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如在seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18、seq id no：20、seq id no：22、seq id no：24、seq id no：26、seq id no：28、seq id no：30、seq id no：32、seq id no：34、seq id no：36、seq id no：38、seq id no：40、seq id no：42、seq id no：44或seq id no：46中陈述的核苷酸序列，及其片段和变体。
[0069]
具体地，实施例提供编码在seq id no：4或seq id no：8中所示的氨基酸序列的分离的核酸分子，或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如在seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18、seq id no：20、seq id no：22、seq id no：24、seq id no：26、seq id no：28、seq id no：30、seq id no：32、seq id no：34、seq id no：36、seq id no：38、seq id no：40、seq id no：42、seq id no：44、和seq id no：46中陈述的核苷酸序列，及其片段和变体。
[0070]
还感兴趣的是编码实施例的杀有害生物蛋白的优化的核苷酸序列。如本文使用的，短语“优化的核苷酸序列”是指针对在特定生物体例如植物中表达而优化的核酸。可以使用本领域已知的方法为任何感兴趣的生物体制备优化的核苷酸序列。参见例如美国专利号7,462,760，其描述了编码所披露的杀有害生物蛋白的优化的核苷酸序列。在本实例中，通过反向翻译蛋白质的氨基酸序列并且改变核苷酸序列来制备核苷酸序列，以便包含玉蜀
黍偏好的密码子，同时仍然编码相同的氨基酸序列。默里(murray)等人(1989)核酸研究(nucleic acids res.)17：477-498更详细地描述了该步骤。最佳的核苷酸序列可应用于增加植物中的杀有害生物蛋白的表达，例如禾本科(gramineae或poaceae)家族的单子叶植物，例如玉蜀黍或玉米植物。
[0071]
在一些实施例中，提供了包含在seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：27、seq id no：29、seq id no：31、seq id no：33、seq id no：35、seq id no：37、seq id no：39、seq id no：41、seq id no：43或seq id no：45中陈述的氨基酸序列的多肽及其片段和变体。
[0072]
在一些实施例中，提供了包含在seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：31、seq id no：33、seq id no：35、seq id no：37、seq id no：39、seq id no：41、seq id no：43或seq id no：45中陈述的氨基酸序列的多肽及其片段和变体。
[0073]
在一些实施例中，提供了包含在seq id no：23、seq id no：25、seq id no：27或seq id no：29中陈述的氨基酸序列的多肽，及其片段和变体。
[0074]
在一些实施例中，提供了与相应的参比cry1b多肽相比具有氨基酸取代的变体cry1b多肽，该变体多肽与“相应的参比cry1b多肽”相比具有增加的针对玉米穗蛾和/或秋粘虫的杀昆虫活性。“相应的参比cry1b多肽”意指本实施例的野生型或天然cry1b多肽或变体cry1b多肽，其可以用作被诱变以产生变体cry1b多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，相应的参比cry1b多肽包含cry1be型结构域i和cry1ah型结构域iii。“cry1be型结构域i”意指与seq id no：58(cry1be)的氨基酸36-276或seq id no：47的氨基酸35-276具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。cry1be(seq id no：58)和mp258(seq id no：47)的结构域i的氨基酸序列比对显示在图3中。类似地，其他天然cry1b多肽可以与cry1be(seq id no：58)和mp258(seq id no：47)进行比对以鉴定其他cry1be型结构域i区域。“cry1ah型结构域iii”意指与seq id no：61(cry1ah)的氨基酸483-643或seq id no：47的氨基酸494-655具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。cry1ah(seq id no：61)、cry1bd(seq id no：1)、cry1bh(seq id no：52)、cry1bi(seq id no：54)和mp258(seq id no：47)的结构域iii的氨基酸序列比对显示于图4中。类似地，其他天然cry1b多肽可以与cry1ah(seq id no：61)、cry1bd、cry1bh(seq id no：52)、cry1bi(seq id no：54)和/或mp258(seq id no：47)进行比对以鉴定其他cry1ah型结构域iii区域。在一些实施例中，相应的参比cry1b多肽包含cry1ba型结构域i和结构域ii。“cry1ba型结构域i和结构域ii”意指与seq id no：55(cry1ba)的氨基酸30-489具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。mp258(seq id no：47)、cry1be
(seq id no：58)、cry1bi(seq id no：54)、cry1bg(seq id no：60)、cry1bf(seq id no：59)、cry1ba(seq id no：55)、cry1bh(seq id no：52)、cry1bd(seq id no：1)、cry1bb(seq id no：56)、和cry1bc(seq id no：57)的结构域i和结构域ii的氨基酸序列比对显示于图5中。类似地，其他天然cry1b多肽可以与cry1ba(seq id no：55)和mp258(seq id no：47)进行比对以鉴定其他cry1ba型结构域i和结构域ii区域。
[0075]
在一些实施例中，相应的参比cry1b多肽包含cry1be型结构域i和结构域ii。“cry1be型结构域i和结构域ii”意指与seq id no：58(cry1be)的氨基酸35-494或seq id no：47的氨基酸35-493具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。mp258(seq id no：47)、cry1be(seq id no：58)、cry1bi(seq id no：54)、cry1bg(seq id no：60)、cry1bf(seq id no：59)、cry1ba(seq id no：55)、cry1bh(seq id no：52)、cry1bd(seq id no：1)、cry1bb(seq id no：56)、和cry1bc(seq id no：57)的结构域i和结构域ii的氨基酸序列比对显示于图5中。类似地，其他天然cry1b多肽可以与cry1be(seq id no：58)和mp258(seq id no：47)进行比对以鉴定其他cry1be型结构域i和结构域ii区域。
[0076]“改进的活性”或“增加的活性”是指与相应的参比cry1b多肽的活性相比，变体蛋白的杀有害生物活性增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％、至少约400％、至少约410％、至少约420％、至少约430％、至少约440％、至少约450％、至少约460％、至少约470％、至少约480％、至少约490％、至少约500％、至少约510％、至少约520％、至少约530％、至少约540％、至少约550％、至少约560％、至少约570％、至少约580％、至少约590％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％或更高，或至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约5倍、至少约5.1倍、至少约5.2倍、至少约5.3倍、至少约5.4倍、至少约5.5倍、至少约5.6倍、至少约5.7倍、至少约5.8倍、至少约5.9倍、至少约6倍、至少约6.1倍、至少约6.2倍、至少约6.3倍、至少约6.4倍、至少约6.5倍、至少约6.6倍、至少约6.7倍、至少约6.8倍、至少约6.9倍、至
少约7倍、至少约7.1倍、至少约7.2倍、至少约7.3倍、至少约7.4倍、至少约7.5倍、至少约7.6倍、至少约7.7倍、至少约7.8倍、至少约7.9倍、至少约8倍、至少约8.1倍、至少约8.2倍、至少约8.3倍、至少约8.4倍、至少约8.5倍、至少约8.6倍、至少约8.7倍、至少约8.8倍、至少约8.9倍、至少约9倍、至少约9.1倍、至少约9.2倍、至少约9.3倍、至少约9.4倍、至少约9.5倍、至少约9.6倍、至少约9.7倍、至少约9.8倍、至少约9.9倍、至少约10倍或更高倍的增加。
[0077]
在一些实施例中，改进由以下组成：相对于相应的参比cry1b多肽的杀有害生物活性，变体cry1b多肽的ec50降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％、至少约400％、至少约410％、至少约420％、至少约430％、至少约440％、至少约450％、至少约460％、至少约470％、至少约480％、至少约490％、至少约500％、至少约510％、至少约520％、至少约530％、至少约540％、至少约550％、至少约560％、至少约570％、至少约580％、至少约590％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％或更多，或至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约5倍、至少约5.1倍、至少约5.2倍、至少约5.3倍、至少约5.4倍、至少约5.5倍、至少约5.6倍、至少约5.7倍、至少约5.8倍、至少约5.9倍、至少约6倍、至少约6.1倍、至少约6.2倍、至少约6.3倍、至少约6.4倍、至少约6.5倍、至少约6.6倍、至少约6.7倍、至少约6.8倍、至少约6.9倍、至少约7倍、至少约7.1倍、至少约7.2倍、至少约7.3倍、至少约7.4倍、至少约7.5倍、至少约7.6倍、至少约7.7倍、至少约7.8倍、至少约7.9倍、至少约8倍、至少约8.1倍、至少约8.2倍、至少约8.3倍、至少约8.4倍、至少约8.5倍、至少约8.6倍、至少约8.7倍、至少约8.8倍、至少约8.9倍、至少约9倍、至少约9.1倍、至少约9.2倍、至少约9.3倍、至少约9.4倍、至少约9.5倍、至少约9.6倍、至少约9.7倍、至少约9.8倍、至少约9.9倍、至少约10倍或更多倍的ec50降低。
[0078]
在一些实施例中，变体cry1b多肽的ec50为＜100ppm、＜90ppm、＜80ppm、＜70ppm、＜60ppm、＜50ppm、＜45ppm、＜40ppm、＜35ppm、＜30ppm、＜25ppm、＜20ppm、＜19ppm、＜18ppm、＜17ppm、＜16ppm、＜15ppm、＜14ppm、＜13ppm、＜12ppm、＜11ppm、＜10ppm、＜9ppm、＜8ppm、＜7ppm、＜6ppm、＜5ppm、＜4ppm、＜3ppm、＜2ppm、＜1ppm、＜0.9ppm、＜0.8ppm、＜0.7ppm、＜0.6ppm、＜0.5ppm、＜0.4ppm、＜0.3ppm、＜0.2ppm或＜0.1ppm。
[0079]
在一些实施例中，改进由以下组成：相对于相应的参比cry1b多肽的杀有害生物活性，变体cry1b多肽的平均fae指数增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、
至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％、至少约400％、至少约410％、至少约420％、至少约430％、至少约440％、至少约450％、至少约460％、至少约470％、至少约480％、至少约490％、至少约500％、至少约510％、至少约520％、至少约530％、至少约540％、至少约550％、至少约560％、至少约570％、至少约580％、至少约590％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％或更高，或至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约5倍、至少约5.1倍、至少约5.2倍、至少约5.3倍、至少约5.4倍、至少约5.5倍、至少约5.6倍、至少约5.7倍、至少约5.8倍、至少约5.9倍、至少约6倍、至少约6.1倍、至少约6.2倍、至少约6.3倍、至少约6.4倍、至少约6.5倍、至少约6.6倍、至少约6.7倍、至少约6.8倍、至少约6.9倍、至少约7倍、至少约7.1倍、至少约7.2倍、至少约7.3倍、至少约7.4倍、至少约7.5倍、至少约7.6倍、至少约7.7倍、至少约7.8倍、至少约7.9倍、至少约8倍、至少约8.1倍、至少约8.2倍、至少约8.3倍、至少约8.4倍、至少约8.5倍、至少约8.6倍、至少约8.7倍、至少约8.8倍、至少约8.9倍、至少约9倍、至少约9.1倍、至少约9.2倍、至少约9.3倍、至少约9.4倍、至少约9.5倍、至少约9.6倍、至少约9.7倍、至少约9.8倍、至少约9.9倍、至少约10倍或更高倍的平均fae指数增加。
[0080]“平均fae指数”(mfi)是指多个faegn的平均值，为faegn的算术平均值。如本文使用的，“平均偏差分数”是指多个偏差分数的算术平均值。
[0081]
在一些实施例中，改进由以下组成：相对于相应的参比cry1b多肽的杀有害生物活性，变体cry1b多肽的平均偏差分数增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％、至少约400％、至少约410％、至少约420％、至少约430％、至少约440％、至少约450％、至少约460％、至少约470％、至少约480％、至少约490％、至少约500％、至少约510％、至少约520％、至少约530％、至少约540％、至少约550％、至少约560％、至少约
570％、至少约580％、至少约590％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％或更高或至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍、至少约4倍、至少约4.1倍、至少约4.2倍、至少约4.3倍、至少约4.4倍、至少约4.5倍、至少约4.6倍、至少约4.7倍、至少约4.8倍、至少约4.9倍、至少约5倍、至少约5.1倍、至少约5.2倍、至少约5.3倍、至少约5.4倍、至少约5.5倍、至少约5.6倍、至少约5.7倍、至少约5.8倍、至少约5.9倍、至少约6倍、至少约6.1倍、至少约6.2倍、至少约6.3倍、至少约6.4倍、至少约6.5倍、至少约6.6倍、至少约6.7倍、至少约6.8倍、至少约6.9倍、至少约7倍、至少约7.1倍、至少约7.2倍、至少约7.3倍、至少约7.4倍、至少约7.5倍、至少约7.6倍、至少约7.7倍、至少约7.8倍、至少约7.9倍、至少约8倍、至少约8.1倍、至少约8.2倍、至少约8.3倍、至少约8.4倍、至少约8.5倍、至少约8.6倍、至少约8.7倍、至少约8.8倍、至少约8.9倍、至少约9倍、至少约9.1倍、至少约9.2倍、至少约9.3倍、至少约9.4倍、至少约9.5倍、至少约9.6倍、至少约9.7倍、至少约9.8倍、至少约9.9倍、至少约10倍或更高倍的平均偏差分数增加。
[0082]
在一些实施例中，变体cry1b多肽的改进的活性是相对于seq id no：1(cry1bd)、seq id no：47(mp258)、seq id no：52(cry1bh)、seq id no：54(cry1bi)、seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、se0 id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：31、seq id no：33、seq id no：35、seq id no：37、seq id no：39、seq id no：41、seq id no：43或seq id no：45的杀有害生物活性而言的。
[0083]
在具体实施例中，实施例的杀有害生物蛋白提供全长杀昆虫多肽、全长杀昆虫多肽的片段和变体多肽，这些多肽、多肽的片段和变体多肽产生自进行设计以将特定的氨基酸序列引入实施例多肽的经诱变的核酸。在具体实施例中，引入多肽的氨基酸序列包含为酶例如蛋白酶提供切割位点的序列。
[0084]
本领域已知bt毒素的杀有害生物活性通常通过各种蛋白酶切割昆虫肠中的肽来活化。因为肽可能不总是在昆虫肠中完全有效切割，所以与全长毒素本身相比，全长毒素的片段可能具有增强的杀有害生物活性。因此，实施例的一些多肽包括全长杀昆虫多肽的片段，并且一些多肽片段、变体和突变将相对于其衍生的天然存在的杀昆虫多肽的活性具有增强的杀有害生物活性，特别是如果在活性筛选之前天然存在的杀昆虫多肽在体外不与蛋白酶一起活化。因此，本技术涵盖序列的截短的版本或片段。
[0085]
只要多肽保留杀有害生物活性，就可以将突变置于任何背景序列中，包括此类截短的多肽。本领域技术人员可以使用本领域已知的或本文别处的描述的试验容易地关于杀有害生物活性比较两种或更多种蛋白质。应当理解的是，实施例的多肽可以通过本文所披露的核酸的表达或通过使用标准分子生物学技术来产生。
[0086]
已经认识到杀有害生物蛋白可能是低聚的，并且在分子量、残基数目、组分肽、针对特定有害生物的活性和其他特征方面将不同。然而，通过本文所述的方法，可以分离和表
征针对各种有害生物具有活性的蛋白质。实施例的杀有害生物蛋白可以与其他bt毒素或其他杀昆虫蛋白组合使用以增加昆虫靶标范围。此外，实施例的杀有害生物蛋白与其他bt毒素或具有不同性质的其他杀昆虫原理组合使用对预防和/或管理昆虫抗性具有特别的效用。其他杀昆虫药剂包括蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸两种类型)、α-淀粉酶和过氧化物酶。
[0087]
核苷酸和氨基酸序列的片段和变体以及由此编码的多肽也涵盖在实施例中。如本文使用的，术语“片段”是指多核苷酸的核苷酸序列的一部分或实施例的多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然或相应的全长蛋白质的生物活性的蛋白质片段，因此拥有杀有害生物活性。因此，公认地是实施例的一些多核苷酸和氨基酸序列可以被正确地称为片段和突变体两者。
[0088]
应当理解的是，术语“片段”，如用于指实施例的核酸序列，还涵盖用作杂交探针的序列。这类核苷酸序列通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段范围可以是从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、至高达编码实施例的蛋白质的全长核苷酸序列。
[0089]
编码实施例的杀有害生物蛋白的生物活性部分的实施例的核苷酸序列的片段将编码至少15个、25个、30个、50个、100个、200个、250个或300个连续氨基酸，或高达存在于实施例的杀有害生物多肽中的氨基酸的总数个连续氨基酸(例如，seq id no：3的651个氨基酸)。因此，应当理解的是，实施例还涵盖作为实施例的示例性杀有害生物蛋白的片段并且具有至少15个、25个、30个、50个、100个、200个、250个或300个连续氨基酸的长度或具有高达存在于实施例的杀有害生物多肽中的氨基酸总数个连续氨基酸的长度(例如，seq id no：3的651个氨基酸)的多肽。可用作杂交探针或pcr引物的实施例的核苷酸序列的片段通常不需要编码杀有害生物蛋白的生物活性部分。因此，实施例的核酸的片段可以编码杀有害生物蛋白的生物活性部分，或者可以是能够用作使用本文披露的方法的杂交探针或pcr引物的片段。杀有害生物蛋白的生物活性部分可以如下制备：分离实施例的核苷酸序列之一的一部分，表达该杀有害生物蛋白的编码部分(例如通过体外重组表达)，并且评价该杀有害生物蛋白的编码部分的活性。
[0090]
作为实施例的核苷酸序列的片段的核酸包含至少16个、20个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、850个、900个或950个核苷酸，或高达存在于本文披露的核苷酸序列中的核苷酸数目个核苷酸(例如，seq id no：4的1953个核苷酸)。具体实施例设想了衍生自(例如，产生自)实施例的第一核酸的片段，其中该片段编码具有杀有害生物活性的截短的毒素。由实施例的多核苷酸片段编码的截短的多肽，相对于由衍生该片段的第一核酸编码的相应全长多肽的活性，具有相当或改进的杀有害生物活性。可以设想，实施例的此类核酸片段可以在天然或相应的全长编码序列的3
′
末端处截短。核酸片段也可以在天然或相应的全长编码序列的5
′
和3
′
端两处截短。
[0091]
本文使用的术语“变体”是指实质上相似的序列。对于核苷酸序列，保守变体包括这样的序列：由于遗传密码的简并性，它们编码实施例的杀有害生物多肽之一的氨基酸序列。本领域普通技术人员将容易地理解，由于遗传密码的简并性，存在编码本披露的许多核苷酸序列。
id no：45的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
[0103]
在一些实施例中，多肽具有修饰的物理性质。如本文使用的，术语“物理性质”是指适合于描述蛋白质的物理化学特征的任何参数。如本文使用的，“感兴趣的物理性质”和“感兴趣的性质”可互换使用，是指正在被研究和/或修饰的蛋白质的物理性质。物理性质的实例包括但不限于蛋白质表面上的净表面电荷和电荷分布、在蛋白质表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水性密度、表面可电离基团的总计数、表面张力、蛋白质大小及其在溶液中的分布、熔解温度、热容量和第二维里系数(second virial coefficient)。物理性质的实例还包括但不限于溶解度、折叠、稳定性和消化率。在一些实施例中，多肽在昆虫肠中对蛋白水解片段具有增加的消化率。在一些实施例中，多肽在昆虫肠中具有增加的稳定性。通过模拟胃液的消化模型是本领域技术人员已知的(富克斯(fuchs，r.l.)和阿斯特伍德(j.d.astwood)，食品工艺学(food technology)50：83-88，1996；阿斯特伍德(astwood，j.d.)等人，自然生物技术(nature biotechnology)14：1269-1273，1996；傅(fu tj)等人，农业与食品化学杂志(j.agric food chem.)50：7154-7160，2002)。
[0104]
实施例进一步涵盖用实施例的至少一种核酸、用包含该核酸的表达盒、或用包含该表达盒的载体转化的微生物。在一些实施例中，微生物是在植物上繁殖的微生物。本披露的实施例涉及包封的杀有害生物蛋白，其包含能够表达实施例的至少一种杀有害生物蛋白的转化的微生物。
[0105]
实施例提供包含实施例的转化的微生物的杀有害生物组合物。在这样的实施例中，转化的微生物通常与合适的载体一起以杀有害生物有效量存在于杀有害生物组合物中。实施例还涵盖杀有害生物组合物，该杀有害生物组合物包含杀有害生物有效量的实施例的分离的蛋白质(单独的或与实施例的转化的生物、和/或实施例的包封的杀有害生物蛋白组合)，连同合适的载体。
[0106]
实施例进一步提供了通过使用实施例的杀有害生物蛋白与至少一种其他或“第二”杀有害生物蛋白组合来增加昆虫靶标范围的方法。本领域已知的任何杀有害生物蛋白可以用于实施例的方法中。此类杀有害生物蛋白包括但不限于bt毒素、蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶和过氧化物酶。
[0107]
实施例还涵盖包含实施例的至少一种核苷酸序列的转化或转基因植物。在一些实施例中，使用包含实施例的至少一种核苷酸序列的核苷酸构建体稳定地转化植物，该核苷酸序列可操作地连接到驱动在植物细胞中表达的启动子。如本文使用的，术语“转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可单独或作为重组表达盒的一部分来整合至基因组中。
[0108]
应该理解，如本文使用的，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。如本文使用的，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过天然发生的事件例如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变所造成的基因组(染色体或染色体外)的改
变。
[0109]
如本文使用的，术语“植物”包括整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其子代。转基因植物的部分在实施例的范围内，并且包括例如植物细胞、植物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块、以及在植物或植物部分(例如胚芽、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、玉米穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药等)中完整的植物细胞，它们来源于具有实施例的dna分子的转基因植物或其先前转化的后代并且因此由转基因细胞的至少部分组成。可以用于实施例的方法中的植物种类通常与适于转化技术的高等植物类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物。
[0110]
虽然实施例不依赖于用于增加植物对植物有害生物的抗性的特定生物学机制，但是实施例的核苷酸序列在植物中的表达可以导致实施例的杀有害生物蛋白的产生和植物对植物有害生物的抵抗力增加。实施例的植物在农业中可应用于影响昆虫有害生物的方法中。某些实施例提供经转化的玉米植物，例如像玉蜀黍植物，其可应用于影响植物的昆虫有害生物(例如鳞翅目有害生物)的方法中。
[0111]“主题植物或植物细胞”是其中遗传改变(例如转化)关于感兴趣的基因已经受到影响的植物或植物细胞，或是从因此改变的植物或细胞遗传而来并且包含该改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量主题植物或植物细胞的表型的变化的一个参考点。
[0112]
对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与用于引起主题植物或细胞的遗传学变化的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料相同的基因型，但已经用无效构建体(即用对感兴趣的性状没有已知的影响的构建体，例如包含标记物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)在主题植物或植物细胞的子代中作为未转化的分离体的植物或植物细胞；(d)与主题植物或植物细胞在遗传上一致，但不暴露于将诱导感兴趣的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)在不表达感兴趣的基因的条件下的主题植物或植物细胞自身。
[0113]
本领域技术人员将容易地认识到分子生物学领域的进步，例如位点特异性和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白质工程化技术提供广泛的工具和方案集，适用于改变或工程化氨基酸序列和农业感兴趣的蛋白质的潜在遗传序列两者。
[0114]
因此，实施例的蛋白质可以用多种方式(包括氨基酸取代、缺失、截短和插入)进行改变。此类操作的方法通常在本领域中是已知的。例如，可以通过将突变引入合成的核酸(例如dna分子)来制备杀有害生物蛋白的氨基酸序列变体。诱变和核酸改变的方法是本领域熟知的。例如，可以使用寡核苷酸介导的定点诱变技术引入设计的改变。参见，例如孔克尔(kunkel)(1985)美国国家科学院院刊82：488-492；孔克尔(kunkel)等人(1987)酶学方法(methods in enzymol.)154：367-382；美国专利号4,873,192；沃克(walker)和哈斯特拉(gaastra)，编辑(1983)分子生物学技术(techniques in molecular biology)(麦克米伦出版公司(macmillan publishing company)，纽约)，以及其中所引用的文献。
[0115]
可以修饰实施例的诱变的核苷酸序列，以便改变存在于编码多肽的一级序列中的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、12个或更多个氨基酸。可替代地，甚至可以引入来自天然序列的更多变化，这样使得编码的蛋白质与相应的野生型蛋白质相比可以使至少约1％或2％、或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、或甚至约13％、14％、
15％、16％、17％、18％、19％、或20％、21％、22％、23％、24％、或25％、30％、35％、或40％或更多的密码子被改变或以其他方式被修饰。以相同的方式，编码的蛋白质与相应的野生型蛋白质相比可以具有至少约1％或2％、或约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、或甚至约13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％、21％、22％、23％、24％、或25％、30％、35％、或40％或更多的另外的密码子。应当理解，实施例的诱变的核苷酸序列旨在涵盖具有杀有害生物活性(例如改进的杀有害生物活性，如通过针对欧洲玉米螟幼虫的拒食性质确定的)的生物功能性、等效肽。此类序列可能由于已知在核酸序列和由此编码的蛋白质中天然存在的密码子冗余和功能性等同的结果而产生。
[0116]
本领域技术人员将认识到，氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、电荷、大小等。考虑了几个前述特征的示例性氨基酸取代基团是本领域技术人员所熟知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0117]
关于不影响感兴趣的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以发现于戴霍夫(dayhoff)等人(1978)蛋白序列与结构图谱(atlas of protein sequence and structure)(国家生物医药研究基金会，华盛顿特区)(natl.biomed.res.found.，washington，d.c.)的模型中，将其通过引用结合在此。可以进行保守的取代，例如用具有相似特性的一个氨基酸取代另一个氨基酸。
[0118]
因此，实施例的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列和突变形式两者。同样地，实施例的蛋白质涵盖天然存在的蛋白质和变体(例如截短的多肽)及其修饰的形式(例如，突变体)两者。此类变体将继续拥有希望的杀有害生物活性。显然，将在编码变体的核苷酸序列中进行的突变一定不能将该序列置于阅读框之外，并且将不创造能够产生二级mrna结构的互补区。参见，ep专利申请公开号75,444。
[0119]
此处包括的蛋白质序列的删除、插入和取代预期不会在蛋白质特性方面产生根本的改变。然而，当难以事先预测取代、缺失或插入的确切影响时，本领域技术人员应当理解，该影响将通过常规筛选试验(例如昆虫摄食试验)来评价。参见，例如马罗内(marrone)等人(1985)经济昆虫学杂志(j.econ.entomol.)78：290-293，以及恰普拉(czapla)和兰(lang)(1990)经济昆虫学杂志(j.econ.entomol.)83：2480-2485，通过引用结合在此。
[0120]
变异核苷酸序列和蛋白质也包括通过诱变和重组方法，如dna改组产生的序列和蛋白质。使用这样的程序，可以操作一个或多个不同的编码序列以创造出拥有所希望的特性的新的杀有害生物蛋白。以这种方式，从包含以下序列区域的相关序列多核苷酸群中产生重组多核苷酸的文库，这些序列区域具有实质的序列同一性并且可以在体外或体内进行同源重组。例如，使用这种方法，可以在实施例的核苷酸序列和其他已知cry核苷酸序列的相应部分之间改组全长编码序列、编码感兴趣结构域的序列基序或实施例的核苷酸序列的任何片段，以获得编码具有改进的感兴趣特性的蛋白质的新基因。
[0121]
感兴趣的特性包括但不限于每单位杀有害生物蛋白的杀有害生物活性、蛋白质稳定性和对非靶标物种(特别是人、牲畜、以及表达实施例的杀有害生物多肽的植物和微生物)的毒性。实施例不受具体的改组策略的束缚，只有实施例或其一部分的至少一个核苷酸序列参与这样的改组策略。改组可能仅涉及本文披露的核苷酸序列，或者可以另外涉及本领域已知的其他核苷酸序列的改组。dna改组的策略在本领域中是公知的。参见，例如施特
默尔(stemmer)(1994)美国国家科学院院刊91：10747-10751；施特默尔(stemmer)(1994)自然(nature)370：389-391；crameri等人(1997)自然生物技术(nature biotech.)15：436-438；摩尔(moore)等人(1997)分子生物学杂志(j.mol.biol.)272：336-347；张(zhang)等人(1997)美国国家科学院院刊94：4504-4509；crameri等人(1998)自然(nature)391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。
[0122]
实施例的核苷酸序列还可以用于从其他生物体(特别是其他细菌、并且更特别地是其他芽孢杆菌属菌株)中分离相应的序列。以这种方式，能够利用例如pcr、杂交等方法，基于其与本文所述序列的序列同源性鉴定此类序列。实施例涵盖基于与在此阐明的全部序列或其片段的序列同一性选择的序列。此类序列包括作为披露的序列的直向同源物的序列。术语“直向同源物”是指来源于共同祖先基因并且由于物种形成发现于不同物种中的基因。在不同物种中发现的基因，当它们的核苷酸序列和/或它们编码的蛋白质序列共有如本文别处所定义的实质同一性时，被认为是直向同源物。直向同源物的功能在不同种之间通常高度保守。
[0123]
在pcr方法中，能够设计用于在pcr反应中使用的寡核苷酸引物，以便由从任何感兴趣的生物体中提取的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物和pcr克隆的方法通常为本领域已知并且被披露于萨姆布鲁克(sambrook)等人(1989)分子克隆：实验手册(molecular cloning：a laboratory manual)(第2版，冷泉港实验室出版(cold spring harbor laboratory press)，纽约州普莱息维尤市(plainview，new york))，在下文中称为“萨姆布鲁克”。还参见英尼斯(innis)等人，编辑(1990)pcr方案：方法与应用指南(pcr protocols：a guide to methods and applications)(学术出版社(academic press)，纽约)；英尼斯和盖尔芬德(gelfand)，编辑(1995)pcr策略(pcr strategies)(学术出版社，纽约)；英尼斯和盖尔芬德，编辑(1999)pcr方法手册(pcr methods manual)(学术出版社，纽约)。已知的pcr方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0124]
在杂交技术中，利用已知核苷酸序列的全部或部分作为探针，该探针选择性杂交来自所选生物体的一群克隆基因组dna片段或cdna片段(即基因组或cdna文库)中存在的其他相应核苷酸序列。杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团(例如
32
p或其他任何可检测标记)来进行标记。因此，例如，可通过基于实施例的序列标记合成的寡核苷酸来制得用于杂交的探针。制备用于杂交的探针和用于构建cdna和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并且披露在萨姆布鲁克中。
[0125]
例如，本文所披露的完整序列、或其一个或多个部分可以用作探针，该探针能够与相应的序列和信使rna特异性杂交。为了在各种条件下实现特异性杂交，此类探针包括对实施例的序列独特的序列，并且长度通常为至少约10或20个核苷酸。此类探针可以用于通过pcr从所选择的生物体中扩增相应的cry序列。可以使用这种技术从所希望的生物体中分离另外的编码序列，或作为用于确定生物体中存在编码序列的诊断试验。杂交技术包括杂交筛选涂板的dna文库(斑块或菌落；参见例如萨姆布鲁克)。
[0126]
此类序列的杂交可以在严格条件下进行。如在此使用的，术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍、5倍或10倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下
将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与该探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，也能够调节严格条件以允许序列中的某些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常探针小于约1000个或500个核苷酸长度。
[0127]
典型地，严格条件将是以下条件：在ph 7.0至8.3下盐浓度为小于约1.5m na离子、典型地约0.01至1.0m na离子浓度(或其他盐类)，并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃，并且对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。添加去稳定剂例如甲酰胺也可以实现严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下与30％至35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50℃至55℃下在1x至2x ssc(20x ssc＝3.0m nacl/0.3m柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0m nacl、1％sds中进行杂交，并且在55℃至60℃下在0.5x至ix ssc中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中杂交，并且在60℃至65℃下在0.1x ssc中最后洗涤至少约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可以包括约0.1％至约1％sds。杂交持续时间通常小于约24小时，通常为约4至约12小时。
[0128]
以下术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质同一性”。
[0129]
(a)如本文使用的，“参比序列”是用作序列比较基础的定义序列。参比序列可以是指定序列的部分或整体；例如，全长cdna或基因序列的片段，或完整的cdna或基因序列。
[0130]
(b)如本文使用的，“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续且指定的片段，其中与用于两个序列的最佳比对的参比序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即缺口)。比较窗口的长度通常为至少20个连续核苷酸，任选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应当理解，由于多核苷酸序列中含有缺口，为了避免与参比序列的高相似性，典型地引入缺口罚分，并且将其从匹配数中减去。
[0131]
用于比较的序列比对的方法是本领域熟知的。因此，任意两个序列之间的百分序列同一性的测定能够用一种数学算法进行。此类数学算法的非限制性实例是迈尔斯(myers)和米勒(miller)(1988)cabios 4：11-17中的算法；史密斯(smith)等人(1981)应用数学进展(adv.appl.math.)2：482中的局部比对算法；内德勒曼(needleman)和文施(wunsch)(1970)分子生物学杂志(j.mol.biol.)48：443-453中的全局比对算法；皮尔森(pearson)和李普曼(lipman)(1988)美国国家科学院院刊85：2444-2448中的搜索局部比对方法；卡林(karlin)和阿特休尔(altschul)(1990)美国国家科学院院刊872264中的算法，如在卡林和阿特休尔(1993)美国国家科学院院刊90：5873-5877中修改的。
[0132]
这些数学算法的计算机实现能够用于序列比较以确定序列同一性。这些实现方法包括，但不限于：pc/基因(pc/gene)程序中的clustal(获自易达利遗传学公司(intelligenetics)，加利福尼亚州山景城(mountain view，califomia))；align程序(版本2.0)以及gcg威斯康星遗传学软件包(gcg wisconsin genetics software package)版本10中的gap、bestfit、blast、fasta、和tfasta(获自accelrys公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿大道9685号(9685 scranton road，san diego，california，usa))。利用这些程序的比对可以使用缺省参数来进行。希金斯(higgins)等人(1988)基因(gene)73：237-244(1988)；希金斯(higgins)等人(1989)cabios 5：151-153；科尔佩(corpet)等人(1988)核酸研究(nucleic acids res.)16：10881-90；黄(huang)等人(1992)cabios 8：155-65；以
及皮尔森(pearson)等人(1994)分子生物学方法(meth.mol.biol.)24：307-331很好地描述了clustal程序。align程序是基于迈尔斯和米勒(1988)同上的算法。当比较氨基酸序列时，align程序可以使用pam120权重残基表，缺口长度罚分为12、缺口罚分为4。阿特休尔等人(1990)分子生物学杂志(j.mol.biol.)215：403的blast程序是基于卡林和阿特休尔(1990)见上文的算法。使用blastn程序、分数＝100、词长＝12可以进行blast核苷酸搜索，以便获得与编码实施例的蛋白质的核苷酸序列序列同源的核苷酸序列。使用blastx程序、分数＝50、词长＝3可以进行blast蛋白质搜索，以便获得与实施例的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用如阿特休尔等人(1997)核酸研究(nucleic acids res.)25：3389中所描述的缺口blast(在blast 2.0中)。可替代地，psi-blast(在blast 2.0中)可以用于进行检测分子之间远缘关系的迭代搜索。参见阿特休尔等人(1997)见上文。当使用blast、缺口blast、psi-blast时，可以使用各自程序的默认参数(例如，用于核苷酸序列的blastn、用于蛋白质的blastx)。参见美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)网站，万维网为ncbi.hlm.nih.gov。还可以通过检查，手动进行比对。
[0133]
(c)如本文使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中“序列同一性”或“同一性”是指当在指定比较窗口中比对最大对应时，两个序列中相同的残基。当针对蛋白质提及序列同一性百分比时，认为不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不完全相同，其中将氨基酸残基取代为具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，因此不改变分子的功能特性。当序列因保守取代而不同时，可以向上调节百分比序列同一性以校正该取代的保守性质。因保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调节的方法是本领域技术人员熟知的。典型地，这涉及作为部分而不是完全错配对保守取代打分，从而提高百分比序列同一性。因此，例如，当完全相同的氨基酸给出1的分数并且非保守取代给出0的分数时，保守取代给出在0和1之间的分数。计算保守取代的分数，例如如在程序pc/基因(易达利遗传学公司，加利福尼亚州山景城)中执行的。
[0134]
(d)如本文使用的，“序列同一性百分比”意指通过对比较窗比较两条最佳比对的序列确定的值，其中如与参比序列(其不包含添加或缺失)比较，该比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。百分比如下计算：测定两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位点数，得到匹配位点数，匹配位点数除以比较窗口中的位点总数，结果乘以100，得到百分序列同一性。
[0135]
(e)(i)术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指多核苷酸当使用所述的比对程序之一使用标准参数与参比序列比较时，包括具有至少70％、80％、90％、或95％或更高的序列同一性的序列。本领域的普通技术人员将会认识到，可以对这些值进行适当地调整以便通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来确定由两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。对于这些目的，氨基酸序列的实质同一性通常意指至少60％、70％、80％、90％、或95％或更高序列同一性的序列同一性。
[0136]
核苷酸序列实质上相同的另一个指征是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，严格条件被选择为在定义的离子强度和ph下比指定序列的tm低约5℃。然而，严格条件涵盖比tm低约1℃至约20℃范围的温度，这取决于如本文别处限制的希望的严格程度。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽实质上相同，则这些核酸实质上相同。例如，当
使用遗传编码允许的最大密码子简并性产生一个拷贝的核酸时，这可能发生。两个核酸序列实质上相同的一个指征是，第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性。
[0137]
(e)(ii)在肽的上下文中，术语“实质同一性”表示肽包含在指定的比较窗口与参比序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的序列。可以使用内德勒曼和文施(1970)同上的全局比对算法来进行出于这些目的的最佳比对。两个肽序列实质上相同的一个指征是一个肽与针对第二个肽的抗体具有免疫反应性。因此，例如，当一个肽与第二个肽只因为保守取代而不同时，这两个肽实质上相同。除了不完全相同的残基位置可能因保守氨基酸改变而不同之外，“实质上相似的”肽共有如上所述的序列。
[0138]
本文使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施例限制为包含dna的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸构成的多核苷酸和寡核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合也可用于本文披露的方法中。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖此类构建体、分子和序列的所有互补形式。而且，实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖可用于转化植物的、实施例的方法中的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合构成的那些。所述脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二者。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖所有形式的核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎-环结构等。
[0139]
进一步的实施例涉及转化的生物体，例如选自下组的生物体，该组由以下各项组成：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类。转化的生物体包括：实施例的dna分子、包含所述dna分子的表达盒、或包含所述表达盒的载体，其可以稳定地并入转化的生物体的基因组中。
[0140]
在dna构建体中提供实施例的序列，用于在感兴趣的生物体中表达。该构建体将包括与实施例的序列可操作地连接的5
′
和3
′
调节序列。如本文使用的，术语“可操作地连接”是指在启动子和第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列引发并介导了相应于该第二序列的dna序列的转录。通常，可操作地连接意指被连接的核酸序列为连续的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续的并且在同一阅读框中。构建体可以另外包含至少一个有待于共转化入生物体中的另外的基因。可替代地，可以在多个dna构建体上提供一个或多个另外的基因。
[0141]
此类dna构建体配备有多个限制位点，这些限制位点用于插入cry毒素序列以使其处于这些调节区的转录调节之下。dna构建体可以另外包含可选择的标记基因。
[0142]
dna构建体在5
′
至3
′
的转录方向上将包括：在作为宿主的有机体中起作用的转录和翻译起始区(即启动子)、实施例的dna序列、以及转录和翻译终止区(即终止区)。转录起始区(即启动子)可以相对于宿主生物体和/或实施例的序列是天然的、类似的、外源的或异源的。另外，启动子可以是天然序列或可替代地，是合成序列。如本文使用的，术语“外源的”表示启动子在引入启动子的天然生物体中没有被发现。在启动子对于实施例的序列而言是“外源的”或“异源的”的情况下，它是指该启动子对于可操作地连接的实施例的序列而言是非天然的或是非天然存在的启动子。如本文使用的，嵌合基因包含可操作地连接至转录起始区的编码序列，该转录起始区相对于该编码序列是异源的。在启动子是天然的或天然序
列的情况下，可操作地连接的序列的表达从野生型表达改变，这导致表型的改变。
[0143]
终止区可以是与该转录起始区天然在一起的，可以是与感兴趣的可操作地连接的dna序列天然在一起的，可以是与植物宿主天然在一起的，或者可以来源于另一种来源(即，对于启动子、感兴趣的dna序列、植物宿主、或其任意组合是外源的或异源的)。
[0144]
方便的终止区可以从根癌农杆菌(a.tumefaciens)的ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见guerineau等人(1991)分子遗传学和基因组学(mol.gen.genet.)262：141-144；普劳德富特(proudfoot)(1991)细胞(cell)64：671-674；sanfacon等人(1991)基因与发育(genes dev.)5：141-149；莫根(mogen)等人(1990)植物细胞(plant cell)2：1261-1272；芒罗(munroe)等人(1990)基因(gene)91：151-158；巴拉斯(ballas)等人(1989)核酸研究(nueleic acids res.)17：7891-7903；以及乔希(joshi)等人(1987)核酸研究(nucleic acid res.)15：9627-9639。
[0145]
在适当的情况下，可以优化核酸以增加宿主生物体中的表达。因此，在宿主生物体是植物的情况下，合成核酸可以使用植物优选的密码子来合成以改进表达。参见，例如，坎贝尔(campbell)和格里(gowri)(1990)植物生理学(plant physiol.)92：1-11，讨论宿主偏好的密码子使用。例如，尽管实施例的核酸序列可以在单子叶植物和双子叶植物两种植物物种中表达，但是可以对序列进行修饰以便解释单子叶植物或双子叶植物的具体密码子偏好和gc含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(默里(murray)等人(1989)核酸研究(nucl.acids res.)17：477-498)。因此，具体氨基酸的玉蜀黍偏好的密码子可以由来自玉蜀黍的已知基因序列推导出。关于来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用在上文默里(murray)等人的表4中列出。本领域中可以获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391，以及默里(murray)等人(1989)核酸研究(nucleic acids res.)17：477-498，通过引用结合在此。
[0146]
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括：编码假的多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列、以及可能不利于基因表达的其他充分表征的序列的消除。可以将序列的gc含量调整至通过参考宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。如本文使用的，术语“宿主细胞”是指含有载体并且支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞、或单子叶植物或双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的实例是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免出现预测的发夹二级mrna结构。
[0147]
表达盒可以另外包含5
′
前导序列。此类前导序列可以起增强翻译的作用。翻译前导区在本领域是已知的，并且包括：微小核糖核酸病毒前导区，例如emcv前导序列(脑心肌炎5
′
非编码区)(埃尔罗伊-斯泰因(elroy-stein)等人，(1989)美国国家科学院院刊，86：6126-6130)；马铃薯y病毒组前导区，例如tev前导区(烟草蚀纹病毒)(加利(gallie)等人(1995)基因(gene)165(2)：233-238)，mdmv前导区(玉蜀黍矮小花叶病毒)，人类免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)(马克雅克(macajak)等人(1991)自然(nature)353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mrna的非翻译前导区(amv rna 4)(乔布林(jobling)等人(1987)自然(nature)325：622-625)；烟草花叶病毒前导区(tmv)(加利(galiie)等人(1989)rna分子生物学(molecular biology of rna)，切赫(cech)编辑(丽丝公司，纽约(liss，new york))，
第237-256页)；以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导区(mcmv；隆梅尔(lommel)等人，(1991)病毒学(virology)81：382-385)。还参见，黛拉-乔帕(della-cioppa)等人(1987)植物生理学(plant physiol.)84：965-968。
[0148]
在制备表达盒时，可以操作各种dna片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的dna序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接dna片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的dna、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。
[0149]
许多启动子可以用于实施例的实践中。可以基于所希望的结果，选择启动子。核酸可以与组成型启动子、组织偏好性启动子、诱导型启动子或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。用于植物宿主细胞中的合适的组成型启动子包括例如rsyn7启动子的核心启动予以及披露于wo 99/43838和美国专利号6,072,050中的其他组成型启动子；核心camv35s启动子(奥德尔(odell)等人(1985)自然(nature)313：810-812)；稻肌动蛋白(麦克尔罗伊(mcelroy)等人(1990)植物细胞(plant cell)2：163-171)；泛素(克里斯滕森(christensen)等人(1989)植物分子生物学(plant mol.biol.)12：619-632以及克里斯滕森(christensen)等人(1992)植物分子生物学(plant mol.biol.)18：675-689)；pemu(拉斯特(last)等人(1991)理论与应用遗传学(theor.appl.genet.)81：581-588)；mas(费尔滕(velten)等人(1984)欧洲分子生物学学会杂志(embo j.)3：2723-2730)；als启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如：在美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中讨论的那些。
[0150]
取决于所希望的结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调节实施例的核苷酸序列在植物中表达的特别感兴趣的是伤口诱导型启动子。这样的伤口诱导型启动子可能对由昆虫摄食引起的损害作出响应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin ii)基因(赖安(ryan)(1990)植物病理学年评(ann.rev.phytopath.)28：425-449；段(duan)等人(1996)自然生物技术(nature biotechnology)14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(斯坦福(stanford)等人(1989)分子遗传学和基因组学(mol.gen.genet.)215：200-208)；系统素(mcgurl等人(1992)科学(science)225：1570-1573)；wip1(rohmeier等人(1993)植物分子生物学(plant mol.biol.)22：783-792；eckelkamp等人(1993)欧洲生物学化学会联盟通讯(febs letters)323：73-76)；mpi基因(corderok等人(1994)植物杂志(plant j.)6(2)：141-150)；以及类似物，通过引用结合在此。
[0151]
另外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中采用病原体诱导型启动子。此类病原体诱导型启动子包括来自发病机制相关的蛋白(pr蛋白)的那些，这些发病机制相关的蛋白在由病原体侵染后被诱导；例如pr蛋白、sar蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如redolfi等人(1983)荷兰植物病理学杂志(neth.j.plant pathol.)89：245-254；uknes等人(1992)植物细胞(plant cell)4：645-656；以及范隆(van loon)(1985)植物分子病毒学(plant mol.virol.)4：111-116。还参见wo 99/43819，通过引用结合在此。
[0152]
感兴趣的是在病原体侵染处或附近局部表达的启动子。参见，例如马里洛尔(marineau)等人(1987)植物分子生物学(plant mol.biol.)9：335-342；马东(matton)等人
(1989)植物-微生物分子相互作用(molecular plant-microbe interactions)2：325-331；绍姆希奇(somsisch)等人(1986)美国国家科学院院刊83：2427-2430；绍姆希奇(somsisch)等人(1988)分子遗传学和基因组学(mol.gen.genet.)2：93-98；以及杨(yang)(1996)美国国家科学院院刊93：14972-14977。还参见，陈(chen)等人(1996)植物杂志(plant j.)10：955-966；张(zhang)等人(1994)美国国家科学院院刊91：2507-2511；沃纳(warner)等人(1993)植物杂志(plant j.)3：191-201；siebertz等人(1989)植物细胞(plant cell)1：961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导的)；以及其中所引用的文献。特别感兴趣的是玉蜀黍prm基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)诱导(参见例如，科德罗(cordero)等人(1992)生理与分子植物病理学(physiol.mol.plant path.)41：189-200)。
[0153]
可以使用化学调节型启动予以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目的，在应用化学品诱导基因表达时启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达时启动子可以是化学阻抑型启动子。化学诱导型启动子在本领域中是已知的，并且包括但不限于玉蜀黍in2-2启动子(其是由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍gst启动子(其是由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草pr-1a启动子(其是由水杨酸激活)。其他感兴趣的化学调节型启动子包括类固醇响应型启动子(参见，例如在schena等人(1991)美国国家科学院院刊88：10421-10425和麦克尼利斯(mcnellis)等人(1998)植物杂志(plant j.)14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见例如加茨(gatz)等人(1991)分子遗传学和基因组学(mol.gen.genet.)227：229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)，通过引用在此结合。
[0154]
组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的杀有害生物蛋白表达。组织偏好性启动子包括在以下参考文献中讨论的那些：山本(yamamoto)等人(1997)植物杂志(plant j.)12(2)255-265；kawamata等人(1997)植物与细胞生理学(plant cell physiol.)38(7)：792-803；汉森(hansen)等人(1997)分子遗传学和基因组学(mol.gen genet.)254(3)：337-343；拉塞尔(russell)等人(1997)转基因研究(transgenic res.)6(2)：157-168；莱因哈特(rinehart)等人(1996)植物生理学(plant physiol)112(3)：1331-1341；范坎普(van camp)等人(1996)植物生理学(plant physiol)112(2)：525-535；canevascini等人(1996)植物生理学(plant physiol)112(2)：513-524；山本(yamamoto)等人(1994)植物与细胞生理学(plant cell physiol.)35(5)：773-778；拉姆(lam)(1994)细胞分化中的结果与问题(results probl.cell differ.)20：181-196；奥罗斯科(orozco)等人(1993)植物分子生物学(plant mol biol.)23(6)：1129-1138；松冈(matsuoka)等人(1993)美国国家科学院院刊(proc natl.acad.sci.usa)90(20)：9586-9590；以及格瓦拉-加西亚(guevara-garcia)等人(1993)植物杂志(plant j.)4(3)：495-505。必要时，此类启动子可以经修饰用于弱表达。
[0155]
叶偏好性启动子在本领域中是已知的。参见，例如山本(yamamoto)等人(1997)植物杂志(plant j.)12(2)：255-265；权(kwon)等人(1994)植物生理学(plant physiol)105：357-67；山本(yamamoto)等人(1994)植物与细胞生理学(plant cell physiol.)35(5)：773-778；戈托尔(gotor)等人(1993)植物杂志(plant j.)3：509-18；奥罗斯科(orozco)等
人(1993)植物分子生物学(plant mol.biol.)23(6)：1129-1138；以及松冈(matsuoka)等人(1993)美国国家科学院院刊90(20)：9586-9590。
[0156]
根偏好性启动子或根特异性启动子是已知的，并且可以从获自文献中的许多来选择或者从各种相容的物种重新分离。参见，例如hire等人(1992)植物分子生物学(plant mol.biol.)20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；凯勒(keller)和鲍姆加特纳(baumgartner)(1991)植物细胞(plant cell)3(10)：1051-1061(在法国菜豆的grp 1.8基因中的根特异性控制元件)；桑格(sanger)等人(1990)植物分子生物学(plant mol.biol.)14(3)：433-443(根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(mas)基因的根特异性启动子)；以及缪(miao)等人(1991)植物细胞(plant cell)3(1)：11-22(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(gs)的全长cdna克隆，其在大豆的根和根结节中表达)。还参见博古什(bogusz)等人(1990)植物细胞(plant cell)2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(paraspoma andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子被连接至β-葡萄糖醛酸酶报告基因并且被引入非豆科植物烟草(nicotiana tabacum)以及豆科植物百脉根(lotus corniculatus)两者中，并且在两个例子中保留了根特异性启动子活性。利奇(leach)和青柳(aoyagi)(1991)描述了他们对发根土壤杆菌(agrobacterium rhizogenes)的高表达的roic和roid根诱导型基因的启动子的分析(参见植物科学(plant science)(利默里克(limerick))79(1)：69-76)。他们推断在那些启动子中增强子和组织优先的dna决定簇不相关联。泰里(teeri)等人(1989)使用与lacz的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的土壤杆菌属(agrobacterium)t-dna基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且tr2
′
基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是用于与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的特征的尤其所希望的组合(参见欧洲分子生物学学会杂志(embo j.)8(2)：343-350)。与nptii(新霉素磷酸转移酶ii)融合的tr1
′
基因显示类似的特征。另外的根偏好性启动子包括vfenod-grp3基因启动子(库斯特(kuster)等人(1995)植物分子生物学(plant mol.biol.)29(4)：759-772)；以及rolb启动子(卡帕纳(capana)等人(1994)植物分子生物学(plant mol.biol.)25(4)：681-691。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。
[0157]“种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的启动子，例如种子储存蛋白的启动子)和“种子发芽性”启动子(在种子发芽期间有活性的启动子)两者。参见汤普森(thompson)等人(1989)生物试验(bioessays)10：108，通过引用结合在此。此类种子偏好性启动子包括但不限于cim1(细胞分裂素诱导的信号)；cz19b1(玉蜀黍19kda玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)(参见美国专利号6,225,529，通过引用结合在此)。γ-玉米蛋白和glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kda玉米蛋白、22kda玉米蛋白、27kda玉米蛋白、g-玉米蛋白、蜡质、收缩素(shrunken)1、收缩素2、球蛋白1等。还参见wo 00/12733，其中披露了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子；通过引用结合在此。在特定组织中具有“偏好性”表达的启动子在该组织中比在至少一种其他植物组织中更大程度地表达。一些组织偏好性启动子显示几乎专门在特定组织中表达。
1595；kleinschnidt等人(1988)生物化学(biochemistry)27：1094-1104；博宁(bonin)(1993)博士毕业论文(ph.d.thesis)，海德堡大学(university of heidelberg)；戈森(gossen)等人(1992)美国国家科学院院刊89：5547-5551；奥利娃(oliva)等人(1992)抗微生物剂与化疗(antimicrob.agents chemother.)36：913-919；hlavka等人(1985)实验药理学手册(handbook of experimental pharmacology)，第78卷(斯普林格出版社(springer-verlag)，柏林(berlin))；以及吉尔(gill)等人(1988)自然(nature)334：721-724。此类公开内容以引用的方式并入本文中。
[0161]
可选择的标记基因的以上列表不意味着具有限制性。任何可选择的标记基因均可用于实施例中。
[0162]
实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物中。“引入”旨在意指以这样一种方式将多核苷酸或多肽提供于植物中以致于该序列得以进入该植物的细胞内部。实施例的这些方法并不取决于将多核苷酸或多肽引入到植物中的具体方法，仅仅是这些多核苷酸或多肽得以进入植物的至少一个细胞内部。用于将多核苷酸或多肽引入植物的方法为本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
[0163]“稳定转化”旨在意指被引入植物中的核苷酸构建体整合到该植物的基因组中并且能够由其子代继承。“瞬时转化”旨在意指将多核苷酸引入植物中并且不整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。
[0164]
转化方案以及将核苷酸序列引入植物内的方案可能取决于用于转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入植物细胞并且随后插入植物基因组的合适方法包括显微注射(crossway等人(1986)生物技术(biotechniques)4：320-334)、电穿孔(里格斯(riggs)等人(1986)美国国家科学院院刊83：5602-5606)、土壤杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(帕什科夫斯基(paszkowski)等人(1984)欧洲分子生物学学会杂志(embo j.)3：2717-2722)、以及弹道粒子加速(参见，例如美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；托姆斯(tomes)等人(1995)植物细胞、组织和器官培养：基本方法(plant cell，tissue，and organ culture：fundamental methods)，编辑gamborg和菲利普斯(phillips)(斯普林格出版社(springer-verlag)，柏林(berlin))；以及麦凯布(mccabe)等人(1988)生物技术(biotechnology)6：923-926)；以及lecl转化(wo 00/28058)。对于马铃薯转化，参见屠(tu)等人(1998)植物分子生物学(plant molecular biology)37：829-838以及崇(chong)等人(2000)转基因研究(transgenic research)9：71-78。另外的转化程序可以发现于魏辛格(weissinger)等人(1988)遗传学年评(ann.rev.genet.)22：421-477；桑福德(sanford)等人(1987)微粒科学与技术(particulate science and technology)5：27-37(洋葱)；赫里斯图(christou)等人(1988)植物生理学(plant physiol.)87：671-674(大豆)；麦凯布(mccabe)等人(1988)生物/技术(bio/technology)6：923-926(大豆)；芬纳(finer)和麦克马伦(mcmullen)(1991)体外细胞与发育生物学(in vitro cell dev.biol.)27p：175-182(大豆)；辛格(singh)等人(1998)理论与应用遗传学(theor.appl.genet.)96：319-324(大豆)；达塔(datta)等人(1990)生物技术(biotechnology)8：736-740(水稻)；克莱因(klein)等人(1988)美国国家科学院院刊85：4305-4309(玉蜀黍)；克莱因(klein)等人(1988)生物技术(biotechnology)6：559-563(玉
蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；克莱因(klein)等人(1988)植物生理学(plant physiol.)91：440-444(玉蜀黍)；弗罗姆(fromm)等人(1990)生物技术(biotechnology)8：833-839(玉蜀黍)；hooykaas-van slogteren等人(1984)自然(nature)(伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷物)；bytebier等人(1987)美国国家科学院院刊84：5345-5349(百合科)；de wet等人(1985)胚珠组织的实验操作(the experimental manipulation of ovule tissues)，编辑查普曼(chapman)等人(朗曼公司(longman)，纽约)，第197-209页(花粉)；凯普勒(kaeppler)等人(1990)植物细胞报告(plant cell reports)9：415-418以及凯普勒(kaeppler)等人(1992)理论与应用遗传学(theor.appl.genet.)84：560-566(晶须介导的转化)；d
′
halluin等人(1992)植物细胞(plant cell)4：1495-1505(电穿孔)；李(li)等人(1993)植物细胞报告(plant cell reports)12：250-255以及克里斯托(christou)和福特(ford)(1995)植物学年鉴(annals of botany)75：407-413(水稻)；osjoda等人(1996)自然生物技术(nature biotechnology)14：745-750(经由根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)的玉蜀黍)；将其全部通过引用结合在此。
[0165]
在具体实施例中，可以使用各种瞬时转化方法将实施例的序列提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于将cry毒素蛋白或其变体和片段直接引入植物或将cry毒素转录物引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如crossway等人(1986)分子遗传学和基因组学(mol gen.genet.)202：179-185；野村(nomura)等人(1986)植物科学(plant sci.)44：53-58；赫普勒(hepler)等人(1994)美国国家科学院院刊91：2176-2180以及hush等人(1994)细胞科学杂志(the journal of cell science)107：775-784，将其全部通过引用结合在此。可替代地，可以使用本领域已知的技术将cry毒素多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统和使多核苷酸以排除随后的dna释放的方式沉淀。因此，可以发生来自粒子结合的dna的转录，但是其被释放以整合到基因组中的频率大大降低。此类方法包括使用涂覆有聚乙亚胺(pei；西格玛公司#p3143)的颗粒。
[0166]
本领域已知用于在植物基因组中的特定位置靶向插入多核苷酸的方法。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统实现多核苷酸在希望的基因组位置的插入。参见例如，wo 99/25821、wo 99/25854、wo 99/25840、wo 99/25855、以及wo 99/25853，将所有文献都通过引用结合在此。简言之，实施例的多核苷酸可以包含在侧翼为两个不完全相同的重组位点的转移盒(transfer cassette)中。将该转移盒引入植物中，该植物已经将靶位点稳定地并入其基因组中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不完全相同的重组位点。提供适当的重组酶，并且将转移盒整合到靶位点。因此，感兴趣的多核苷酸整合在植物基因组中的特定染色体位置。
[0167]
已经转化的细胞可以按照常规方法生长为植物。参见，例如麦考密克(mccormick)等人(1986)植物细胞报告(plant cell reports)5：81-84。然后，这些植物可以生长，且用相同的转化株或不同的株授粉，并且产生的杂种具有经鉴定的、希望的表型特征的组成型或诱导型表达。可以生长两代或两代以上以确保希望的表型特征的表达稳定保持并且遗传，然后收获种子以确保希望的表型特征已经实现表达。
[0168]
可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触来将实施例的核苷酸序列提供给植物。通常，此类方法涉及将感兴趣的核苷酸构建体掺入病毒dna或rna分子内。已经认识到，实施例
radiata))；花旗松(北关海滨黄杉(pseudotsuga menziesii))；西部铁杉(加拿大铁杉(tsuga canadensis))；西加云杉(白云杉(picea glauca))；红杉(加州红杉(sequoia sempervirens))；冷杉例如银枞(胶冷杉(abies amabilis))以及香脂冷杉(加拿大胶杉(abies balsamea))；以及雪松例如北关乔柏(大侧柏(thuja plicata))和阿拉斯加黄杉木(黄扁柏(chamaecyparis nootkatensis))。实施例的植物包括作物植物，包括但不限于：玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属(brassica spp.)、大豆、棉花、红花、落花生、高粱、小麦、小米、烟草、甘蔗等。
[0172]
草坪草包括但不限于：一年生蓝草(一年生早熟禾(poa annua))；一年生黑麦草(多花黑麦草(lolium multiflorum))；加拿大莓系(加拿大早熟禾(poa compressa))；紫羊茅(chewings fescue或festuca rubra)；细弱剪股颖(colonial bentgrass或agrostis tenuis)；匍匐剪股颖(剪股颖(agrostis palustris))；麦穗草(沙生冰草(agropyron desertorum))；扁穗冰草(冰草(agropyron cristatum))；硬羊茅(羊茅叶(festuca longifolia))；肯塔基蓝草(草地早熟禾(poa pratensis))；鸭茅(orchardgrass或dactylis glomerata)；黑麦草(多年生黑麦草(lolium perenne))；红狐茅(紫羊茅(festuca rubra))；小糠草(白翦股颖(agrostis alba))；粗茎莓系草(普通早熟禾(poa trivialis))；羊茅(羊茅草(festuca ovina))；无芒雀麦(无芒雀麦草(bromus inermis))；高羊茅(苇状羊茅(festuca arundinacea))；梯牧草(猫尾草(phleum pratense))；天鹅绒翦股颖(绒毛剪股颖(agrostis canina))；垂枝碱茅(碱茅(puccinellia distans))；西部麦草(蓝茎冰草(agropyron smithii))；狗牙根(狗牙根属(cynodon spp.))；圣奥古斯丁草(奥古斯丁草(stenotaphrum secundatum))；结缕草(结缕草属(zoysia spp.))；巴哈雀稗(百喜草(paspalum notatum))；地毯草(狭叶地毯草(axonopus affinis))；蜈蚣草(假俭草(eremochloa ophiuroides))；饲用狼尾草(狼尾草(pennisetum clandesinum))；海滨雀稗(海雀稗(paspalum vagmatum))；格兰马草(blue gramma或(bouteloua gracilis)；水牛草(野牛草(buchloe dactyloids))；垂穗草(sideoats gramma或bouteloua curtipendula)。
[0173]
感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。感兴趣的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦、小米等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、赖马豆、蚕豆、滨豆、鹰嘴豆等。
[0174]
在某些实施例中，实施例的核酸序列可以与感兴趣的多核苷酸序列的任何组合堆叠以产生具有希望的表型的植物。例如，实施例的多核苷酸可以与任何其他编码具有杀有害生物和/或杀昆虫活性的多肽(例如其他bt毒素蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；以及盖泽(geiser)等人(1986)基因(gene)48：109中)、五邻体(pentin)(描述于美国专利号5,981,722中)以及类似物)的多核苷酸堆叠。产生的组合还可以包括感兴趣的多核苷酸中的任何一个的多个拷贝。实施例的多核苷酸还可以与任何其他基因或基因的组合堆叠以产生具有各种希望的性状组合的植物，这些性状组合包括但不限于对于动物饲料希望的性状例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸(例如羟丁硫素(hordothionin)(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,049)；大麦高赖氨酸(威廉姆森(williamson)等人(1987)欧洲生物化学杂志
(eur.j.biochem.)165：99-106；和wo 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白质(佩德森(pedersen)等人(1986)生物化学杂志(j.biol.chem.)261：6279；桐原(kirihara)等人(1988)基因(gene)71：359；以及musumura等人(1989)植物分子生物学(plant mol.biol.)12：123))；增加的消化率(例如，改良的储存蛋白(美国专利6,858,778))和；以及硫氧还蛋白(美国专利号7,009,087)，其披露内容通过引用结合在此。
[0175]
实施例的多核苷酸还可以与如下各项堆叠：对于病害或除草剂抗性希望的性状(这些性状例如是，伏马菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和病害抗性基因(琼斯(jones)等人(1994)科学(science)266：789；马丁(martin)等人(1993)科学(science)262：1432；和mindrinos等人(1994)细胞(cell)78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(als)突变体，例如s4和/或hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂例如草丁膦或巴斯塔(basta)(例如bar基因)；和草甘膦抗性(epsps基因和gat基因，如美国专利号7,709,702；和7,462,481中所披露的；以及对于加工或加工产品希望的性状例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改良的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；wo 94/11516))；改良的淀粉(例如，adpg焦磷酸化酶(agpase)、淀粉合成酶(ss))、淀粉分支酶(sbe))和淀粉脱支酶(sdbe))；以及聚合物或生物塑料(例如美国专利号5,602,321；p-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合成酶和乙酰乙酰基辅酶a还原酶(舒伯特(schubert)等人(1988)细菌学杂志(j.bacteriol.)170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(pha)表达)，其披露内容通过引用结合在此。还可以将实施例的多核苷酸与提供农学性状(例如雄性不育(例如参见美国专利号5.583,210)、茎强度、开花时间或转化技术性状(例如细胞周期调节或基因靶向(例如wo 99/61619；wo 00/17364；wo 99/25821))的多核苷酸组合，其披露内容通过引用结合在此。
[0176]
在一些实施例中，堆叠的性状可以是已经获得监管许可的性状或事件，这些监管许可是本领域技术人员熟知的并且可以在环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，其可以使用www前缀进行访问)和在国际农业生物技术应用服务部门(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，其可以使用www前缀进行访问)找到。
[0177]
这些堆叠的组合可以通过任何方法来产生，这些方法包括但不限于：通过任何常规的或顶交方法进行的植物杂交育种、或遗传转化。如果通过对植物进行遗传转化来堆叠这些性状，那么感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时候并且以任何顺序组合。例如，包括一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。这些性状可以在通过转化盒的任何组合所提供的具有感兴趣的多核苷酸的共转化方案中同时引入。例如，如果将引入两个序列，那么这两个序列可以包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一个转化盒中(顺式)。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能所希望的是引入一种将抑制所关注的聚核苷酸的表达的转化盒。此可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所需性状组合。进一步认识到多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统在希望的基因组位置上堆叠。参见例如，wo 99/25821、wo 99/25854、wo 99/25840、wo 99/25855、以及wo 99/25853，将所有文献都通过引用结合在此。
[0178]
实施例的组合物可应用于以各种方式保护植物、种子和植物产品。例如，组合物可以用于涉及通过一种程序将有效量的杀有害生物组合物置于有害生物环境中的方法中，该程序选自下组，该组由以下各项组成：喷雾、喷粉(dusting)、播撒或种子包衣。
[0179]
在植物繁殖材料(果实、块茎、鳞茎、球茎、颗粒、种子)，特别是种子作为商业产品出售之前，通常用包含除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、或这些制剂中的几种的混合物来进行处理，如果需要，还可与配制品领域通常使用的另外的载体、表面活性剂或应用促进助剂一起进行处理以提供保护从而不受由细菌、真菌或动物有害生物引起的损害。为了处理种子，保护剂包衣可以通过用液体配制品浸渍块茎或谷粒或通过用组合的湿或干的配制品对其涂覆而施用于种子。另外，在特殊情况下，其他施用于植物的方法是可能的，例如针对芽或果实的处理。
[0180]
包含编码实施例的杀有害生物蛋白的核苷酸序列的实施例的植物种子可以用包含种子处理化合物的种子保护剂包衣来处理，该种子保护剂包衣包括例如克菌丹、萎锈灵、福关双、甲霜灵(memalaxyl)、甲基嘧啶磷和常用于种子处理的其他药剂。在一个实施例中，包含实施例的杀有害生物组合物的种子保护剂包衣单独使用或与通常用于种子处理的种子保护剂包衣之一组合使用。
[0181]
已经认识到，编码杀有害生物蛋白的基因可以用于转化昆虫病原生物体。此类生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。
[0182]
可以将编码实施例的杀有害生物蛋白的基因经由合适的载体引入微生物宿主中，并且将所述宿主应用于环境或植物或动物。在将核酸插入细胞中的上下文中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”并且包括指将核酸并入真核或原核细胞中，其中可以使核酸并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体dna)中、转化成自主复制子、或瞬时表达(例如，转染的mrna)。
[0183]
可以选择已知占据一种或多种感兴趣的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供表达杀有害生物蛋白的基因的稳定维持和表达，并且期望地，提供改进的杀有害生物剂的保护以免于环境降解和失活。
[0184]
此类微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是以下微生物：例如细菌，例如假单胞菌属(pseudomonas)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、克雷伯菌属(klebsiella)、黄单胞菌属(xanthomonas)、链霉菌属(streptomyces)、根瘤菌属(rhizobium)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、methylius、土壤杆菌属(agrobacterium)、醋杆菌属(acetobacter)、乳杆菌属(lactobacillus)、节细菌属(arthrobacter)、固氮菌属(azotobacter)、明串珠菌属(leuconostoc)和产碱杆菌属(alcaligenes)，真菌，尤其是酵母，例如酵母属(saccharomyces)、隐球菌属(cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、掷孢酵母属(sporobolomyces)、红酵母属(rhodotorula)和短梗霉(aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈细菌物种，例如丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、木醋杆菌(acetobacter xylinum)、农杆菌(agrobacteria)、球红假单胞菌(rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(rhizobium melioti)、富养产碱杆菌(alcaligenes entrophus)、木质棒形杆菌(clavibacter xyli)和棕色固氮菌(azotobacter vinelandii)，以及植物圈酵母物种，例如深红类酵母菌(rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(r.glutinis)、海滨红酵母(r.marina)、桔红酵母(r.aurantiaca)、
白色隐球菌(cryptococcus albidus)、液化隐球菌(c.diffluens)、罗伦隐球酵母(c.laurentii)、罗塞伊酵母菌(saccharomyces rosei)、普地酵母(s.pretoriensis)、酿酒酵母(s.cerevisiae)、红掷孢酵母(sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(s.odorus)、佛地克鲁维氏酵母(kluyveromyces veronae)、和禾口出芽短梗霉(aureobasidium pollulans)。特别感兴趣的是有颜色的微生物。
[0185]
在允许基因的稳定维持和表达的条件下，可以获得许多方法来将表达杀有害生物蛋白的基因引入微生物宿主中。例如，可以构建表达盒，该表达盒包括与用于表达核苷酸构建体的转录和翻译调控信号可操作地连接的感兴趣的核苷酸构建体，以及与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列，由此发生整合，和/或在宿主中起作用的复制系统，由此发生整合或稳定维持。
[0186]
转录和翻译调控信号包括但不限于启动子、转录起始的起始位点、操纵子、激活子、增强子、其他调控元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见例如美国专利号5,039,523和4,853,331；epo 0480762 a2；萨姆布鲁克；马尼亚蒂斯(maniatis)等人(冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港(cold spring harbor，new york))；戴维斯(davis)等人，编辑(1980)高等细菌遗传学(advanced bacterial genetics)(冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港)以及其中所引用的文献)。
[0187]
适当的宿主细胞(其中当经处理的细胞应用于一种或多种靶标有害生物的环境时，将处理含有杀有害生物蛋白的细胞以延长细胞中的杀有害生物蛋白的活性)可以包括原核生物或真核生物，通常限于那些对高等生物体(例如哺乳动物)不产生有毒物质的细胞。然而，可以使用对高等生物体产生有毒物质的生物体，其中毒素是不稳定的或其应用水平足够低以致于避免对哺乳动物宿主产生毒性的任何可能。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和低等真核生物，例如真菌。例证性原核生物(革兰阴性和革兰氏阳性两者)包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如埃希氏杆菌属(escherichia)、欧文氏菌属(erwinia)、志贺氏菌属(shigella)、沙门氏菌属(salmonella)和变形杆菌属(proteus)；芽孢杆菌科(bacillaceae)；根瘤菌科(rhizobiaceae)，例如根瘤菌属(rhizobium)；螺旋藻科(spirillaceae)，例如发光杆菌属(photobacterium)、发酵单胞菌属(zymomonas)、沙雷氏菌属(serratia)、气单胞菌属(aeromonas)，弧菌属(vibrio)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、螺旋藻属(spirillum)；乳杆菌科(lactobacillaceae)；假单胞菌科(pseudomonadaceae)，例如假单胞菌属(pseudomonas)和醋菌属(acetobacter)；固氮菌科(azotobacteraceae)和硝化杆菌科(nitrobacteraceae)。在真核生物中是真菌，例如藻菌纲(phycomycetes)和子囊菌纲(ascomycetes)，包括酵母，例如酵母属和裂殖酵母属(schizosaccharomyces)；和担子菌纲(basidiomycetes)酵母，例如红酵母属、短梗霉属、掷孢酵母属等。
[0188]
出于杀有害生物蛋白生产目的在宿主细胞中选择的特别感兴趣的特征包括易于将杀有害生物蛋白基因引入宿主、表达系统的可用性、表达的效率，宿主中蛋白质的稳定性、和辅助基因功能的存在。用作杀有害生物剂微胶囊的感兴趣的特征包括杀有害生物剂的保护性质，例如厚细胞壁、色素沉着、以及细胞内包装或包涵体的形成；叶亲和力、没有哺乳动物毒性；吸引有害生物摄取；容易杀死和修复而不损害毒素；等等。其他考虑因素包括易于配制和处理、经济性、储存稳定性等。
[0189]
特别感兴趣的宿主生物体包括酵母，例如红酵母属、短梗霉属、酵母属(例如酿酒酵母)、掷孢酵母属；叶面生物体，例如假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌)、欧文氏菌属、和黄杆菌属(flavobacterium spp.)以及其他这样的生物，包括bt、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
[0190]
可以将编码实施例的杀有害生物蛋白的基因引入在植物上繁殖的微生物(附生植物)中，以将杀有害生物蛋白递送至潜在的靶标有害生物。例如，附生植物可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
[0191]
例如，定植根部的细菌可以通过本领域已知的方法从感兴趣的植物中分离。具体地，定植根部的蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)菌株可以从植物的根分离(参见例如汉德尔斯曼(handelsman)等人(1991)应用与环境微生物学(appl.environ.microbiol.)56：713-718)。可以通过本领域已知的标准方法将编码实施例的杀有害生物蛋白的基因引入定植根部的蜡样芽胞杆菌。
[0192]
编码杀有害生物蛋白的基因可以例如通过电转化引入定植根部的芽孢杆菌中。具体地，可以将编码杀有害生物蛋白的基因克隆到穿梭载体中，例如pht3101(lerecius等人(1989)fems微生物通讯(fems microbiol.letts)60：211-218)。包含特定杀有害生物蛋白基因的编码序列的穿梭载体pht3101例如可以通过电穿孔转化到定植根部的芽孢杆菌中(lerecius等人(1989)fems微生物通讯(femsmicrobiol.letts)60：211-218)。
[0193]
可以设计表达系统，这样使得在例如大肠杆菌等革兰氏阴性细菌的细胞质外分泌杀有害生物蛋白。具有分泌的杀有害生物蛋白的优点是：(1)避免表达的杀有害生物蛋白的潜在细胞毒性作用；以及(2)提高杀有害生物蛋白的纯化效率，包括但不限于提高每体积细胞培养液的蛋白质的回收和纯化的效率，以及降低每单位蛋白质的回收和纯化的时间和/或成本。
[0194]
可以使得杀有害生物蛋白在大肠杆菌中分泌，例如通过将合适的大肠杆菌信号肽融合到杀有害生物蛋白的氨基末端。由大肠杆菌识别的信号肽可以发现于已知在大肠杆菌中分泌的蛋白质(例如ompa蛋白)中(格拉耶布(ghrayeb)等人(1984)欧洲分子生物学学会杂志(embo j)3：2437-2442)。ompa是大肠杆菌外膜的主要蛋白质，因此其信号肽被认为在易位过程中是有效的。而且，ompa信号肽在处理之前不需要像其他信号肽(例如脂蛋白信号肽)的情况下那样被修饰(duffaud等人(1987)酶学方法(meth.enzymol.)153：492)。
[0195]
实施例的杀有害生物蛋白可以在细菌宿主中发酵，并且所得的细菌以与bt菌株已被用作杀昆虫喷雾相同的方式处理并且用作微生物喷雾。在从芽孢杆菌分泌的杀有害生物蛋白的情况下，使用本领域已知的程序除去或突变分泌信号。这样的突变和/或缺失在发酵过程期间防止一种或多种杀有害生物蛋白分泌到生长培养基中。杀有害生物蛋白被保留在细胞内，然后处理细胞以产生包封的杀有害生物蛋白。任何合适的微生物都可用于这个目的。已经使用假单胞菌来表达bt毒素作为包封的蛋白质，并且将所得的细胞作为杀昆虫剂进行处理和喷雾(盖特纳(gaermer)等人(1993)，高等工程化杀有害生物剂(advanced engineered pesticides)，编辑金(kim))。
[0196]
可替代地，通过将异源基因引入细胞宿主中来生产该杀有害生物蛋白。该异源基因的表达直接或间接地导致该杀有害生物剂的细胞内产生和维持。然后，在当细胞被施用到一种或多种靶标有害生物的环境时延长在细胞中产生的毒素的活性的条件下对这些细
胞进行处理。得到的产物保留该毒素的毒性。然后，可以按照常规技术来配制这些天然的包封的杀有害生物蛋白，用于施用到寄宿着靶标有害生物的环境(例如，土壤、水、和植物的叶子)。参见，例如ep 0192319，以及其中所引用的文献。
[0197]
在实施例中，转化的微生物(其包括整个生物体、细胞、一个或多个孢子、一种或多种杀有害生物蛋白、一种或多种杀有害生物组分、一种或多种影响有害生物的组分、一个或多个突变体、活细胞或死细胞和细胞组分，包括活细胞和死细胞的混合物和细胞组分、并且包括破碎的细胞和细胞组分)或分离的杀有害生物蛋白可以与可接受的载体配制成一种或多种杀有害生物组合物(即，例如悬浮液、溶液、乳剂、喷粉粉末、可分散颗粒或丸剂、可湿性粉剂和可乳化浓缩物、气雾剂或喷雾剂、浸渍颗粒剂、佐剂、可包衣糊剂、胶体)，并且还包封在例如聚合物物质中。这样的配制组合物可以通过常规方法例如包含多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均质化、萃取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备。
[0198]
上文披露的组合物可以通过添加表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、摄食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、uv保护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养素供体或其他影响植物生长的制剂来获得。包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料的一种或多种农用化学品可以与配制品或其他组分领域中通常采用的载体、表面活性剂或佐剂组合，以促进产品处理和特定靶标有害生物的应用。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且相应于在配制技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。实施例的活性成分通常以组合物的形式施用，并且可以施用于待处理的作物区域、植物或种子。例如，实施例的组合物可以在谷仓或筒仓等的准备中或储存期间施用于谷粒。实施例的组合物可以与其他化合物同时或相继施用。施用实施例的活性成分或实施例的农用化学组合物(该组合物包含由实施例的细菌菌株产生的杀有害生物蛋白中的至少一种)的方法包括但不限于叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用比率取决于被相应的有害生物侵染的强度。
[0199]
合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物，例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；n-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或二酯或这些酯的盐；脂肪醇硫酸盐，例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐，例如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如丁基-萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐，例如酰胺磺酸盐，例如油酸和n-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯磺酸钠。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪-烷基-或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物；多元醇醚的脂肪酯，例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯；此类酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯；环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物；炔属二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇或乙氧基化乙炔二醇。阳离子表面活性剂的实例包括：例如脂肪族单-、二-或多胺，例如乙酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺，例如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或多胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。
[0200]
惰性材料的实例包括但不限于无机矿物，例如高岭土、层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐；或植物性材料，例如软木、粉末化玉米穗轴、花生壳、稻壳和核桃壳。
[0201]
实施例的组合物可以是处于合适的形式，用于直接施用或作为主要组合物的浓缩物，该浓缩物在施用前需要用适量的水或其他稀释剂的稀释。杀有害生物浓度将取决于具体配制品的性质(具体而言，是浓缩物还是直接施用)而变化。组合物包含1％至98％的固体或液体惰性载体，以及0％至50％或0.1％至50％的表面活性剂。这些组合物将以商业产品的标记速率给予，例如当处于干燥形式时为约0.01 1b-5.0 1b/英亩，并且当处于液体形式时为约0.01pts.-10pts./英亩。
[0202]
在进一步的实施例中，组合物以及实施例的转化的微生物和杀有害生物蛋白可以在配制之前进行处理，以便当施用于靶标有害生物的环境时延长杀有害生物活性，只要该预处理对杀有害生物活性不会有害。这样的处理可以通过化学和/或物理方法进行，只要处理不会有害地影响一种或多种组合物的特性。化学试剂的实例包括但不限于卤化剂；醛类例如甲醛和戊二醛；抗感染剂，例如氯化苯甲烃铵(zephiran chloride)；醇，例如异丙醇和乙醇；和组织学固定剂，如布安氏固定剂(bouin
′
s fixative)和赫利氏固定剂(helly
′
s fixative)(参见，例如赫马森(humason)(1967)动物组织技术(animal tissue techniques)(弗里曼和公司(w.h.freeman and co.)))。
[0203]
在其他实施例中，在将实施例的杀有害生物蛋白组合物施用于靶标有害生物的环境之前，用蛋白酶(例如胰蛋白酶)处理cry毒素多肽可能有益于活化该蛋白质。通过丝氨酸蛋白酶活化原毒素的方法是本领域熟知的。参见，例如，库克西(cooksey)(1968)生物化学杂志(biochem.j.)6：445-454，以及卡罗尔(carroll)和艾拉(ellar)(1989)生物化学杂志(biochem.j.)261：99-105，其传授内容通过引用结合在此。例如，合适的活化方案包括但不限于将待活化的多肽(例如纯化的新颖cry多肽(例如，具有seq id no：4或seq id no：8所示的氨基酸序列))和胰蛋白酶以蛋白质/胰蛋白酶的1/100重量比在20nm nahco3(ph 8)中组合，并且在36℃下将样品消化3小时。
[0204]
可以通过例如喷雾、雾化、喷粉、散射、涂覆或浇注，在有害生物已经开始出现的时间或在有害生物出现之前作为保护措施引入到土壤中或土壤上、引入灌溉水中、通过种子处理或一般施用或喷粉，将组合物(包括实施例的转化的微生物和杀有害生物蛋白)施用到昆虫有害生物的环境中。例如，实施例的杀有害生物蛋白和/或转化的微生物可以与谷粒混合以在储存期间保护谷粒。总体而言重要的是，在植物生长的早期阶段获得对有害生物的良好控制，因为这是植物可能受到最严重损害的时间。如果认为必要，实施例的组合物可以方便地包含另一种杀昆虫剂。在一个实施例中，组合物在种植时以载体和实施例的芽孢杆菌属菌株或转化的微生物的死细胞的组合物的颗粒形式直接施用于土壤。另一个实施例是包含农用化学品(例如像除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体)和实施例的芽孢杆菌属菌株或转化的微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。
[0205]
本领域技术人员将认识到并不是所有的化合物对所有有害生物同样有效。实施例的化合物显示针对昆虫有害生物的活性，该昆虫有害生物可以包括经济上重要的农艺、森林、温室、苗圃、观赏植物、食物和纤维、公共和动物健康、家庭和商业建筑物、家庭和储存产品有害生物。昆虫有害生物包括选自以下目的昆虫：鞘翅目(coleoptera)、双翅目(diptera)、膜翅目(hymenoptera)、鳞翅目(lepidoptera)、食毛目(mallophaga)、同翅目(homoptera)、半翅目(hemiptera)、直翅目(orthroptera)、缨翅目(thysanoptera)、革翅目(dermaptera)、等翅目(isoptera)、虱目(anoplura)、蚤目(siphonaptera)、毛翅目
(trichoptera)等，尤其是鞘翅目和鳞翅目。
[0206]
鳞翅目的昆虫包括但不限于夜蛾科的粘虫、夜蛾、尺蠖和棉铃虫：小地老虎(agrotis ipsilon hufnagel)(黑色地老虎)；莫里森地胖夜蛾(a.orthogonia morrison)(西部夜蛾)；菁夜蛾(a.segetum denis&schifferm
ü
ller)(萝卜蛾)；颗粒夜蛾(a.subterranea fabricius或granulate cutworm)；棉叶虫(alabama argillacea h
ü
bner或cotton leaf worm)；黎豆夜蛾(anticarsia gemmatalis h
ü
bner)(天鹅绒毛虫)；粗皮夜蛾(athetis mindara barnes and mcdunnough)(粗皮夜蛾)；埃及金刚钻(earias insulana boisduval)(多刺螟蛉)；斑点螟蛉(e.vittella fabricius或spotted bollworm)；柑橘夜蛾(egira(xylomyges)curialis grote)(柑橘夜蛾)；暗缘地老虎(euxoa messoria harris)(暗缘夜蛾)；玉米穗蛾(helicoverpa armigera h
ü
bner)(美国螟蛉虫)；谷实夜蛾(h.zea boddie)(玉米穗蛾或棉铃虫)；烟草夜蛾(heliothis virescens fabricius)(烟草夜蛾幼虫)；苜蓿绿夜蛾(hypena scabra fabricius)(苜蓿绿夜蛾)；稽带夜蛾(mamestra configurata walker)(披肩粘虫)；甘蓝菜蛾(m.brassicae linnaeus或cabbage moth)；纹碟毛虫(melanchra picta harris)(斑马纹毛虫)；花椒粘虫(pseudaletia unipuncta haworth)(粘虫)；大豆夜蛾(pseudoplusia includens walker)(大豆尺蠖)；西部豆夜蛾(richia albicosta smith或western bean cutworm)；草地夜蛾(spodoptera frugiperda je smith)(秋粘虫)；甜菜夜蛾(s.exigua h
ü
bner)(甜菜粘虫)；斜纹夜蛾(烟草夜蛾、茶蚕)；粉纹夜蛾(trichoplusia ni h
ü
bner)(甘蓝尺蠖)；来自螟蛾科的螟虫、鞘蛾、结网毛虫、coneworm和食叶虫；草螟科例如小蜡螟(achroia grlsella fabricius或lesser wax moth)；脐橙螟(amyelois transitella walker或naval orangeworm)；地中海粉斑螟(anagasta kuehniella zeller)(地中海粉螟)；干果斑螟(cadra cautella walker)(杏仁蛾)；斑禾草螟(chilo partellus swinhoe)(茎斑螟虫)；二化螟(c.suppressalis walker)(条纹茎/水稻螟虫)；甘蔗二点螟(甘蔗茎螟)；米螟(corcyra cephalonica stainton)(米蛾)；玉米根结网毛虫(crambus caliginosellus clemens或corn root webworm)；早熟禾草螟(c.teterrellus zincken)(蓝草结网毛虫)；稻纵卷叶螟(cnaphalocrocis medinalis guen
é
e或rice leaf roller)；葡萄小卷叶野螟(葡萄纵卷叶螟)；甜瓜绢野螟(diaphania hyalinata linnaeus)(甜瓜野螟)；泡菜虫(d.nitidalis stoll或pickleworm)；西南玉米螟(diatraea grandiosella dyar或southwestern corn borer)；甘蔗螟(d.saccharalis fabricius)(甘蔗螟虫)；南美玉米苗斑螟(elasmopalpus lignosellus zeller)(小玉米茎蛀虫)；墨西哥水稻螟(eoreuma loftini dyar)(墨西哥水稻螟虫)；烟草粉斑螟(ephestia elutella h
ü
bner)(烟草(可可)蛾)；大蜡螟(galleria mellonella linnaeus或greater wax moth)；甘蔗卷叶螟(hedylepta accepta butler或sugarcane leafroller)；野螟(herpetogramma licarsisalis walker)(草地螟)；向日葵同斑螟(homoeosoma electellum hulst)(向日葵螟)；草地螟(loxostege sticticalis linnaeus或beet webworm)；豆荚野螟(maruca testulalisgeyer)(豇豆荚螟)；茶树螟(orthaga thyrisalis walker)(茶树网蛾)；玉米螟(ostrinia nubilalis h
ü
bner)(欧洲玉米螟)；印度谷螟(plodia interpunctella h
ü
bner或indian meal moth)；三化螟(scirpophaga incertulas walker或yellow stem borer)；芹菜卷叶螟(udearubigalis guen
é
e或celery leaftier)；和来自卷蛾科草莓长翅卷蛾(西
方黑头锡蚜虫)的卷叶蛾、蚜虫、种子蠕虫和果实蠕虫；漂头长翅卷蛾(a.variana fernald)(东方黑头锡蚜虫)；苹果小卷叶蛾(adoxophyes orana fischer
·
)(苹果小卷蛾)；黄卷蛾属(archips spp.)包括果树卷叶蛾(a.argyrospila walker或fruit tree leaf roller)和欧洲卷叶蛾(a.rosana linnaeus或european leaf roller)；红带卷蛾(argyrotaenia spp.)；巴西苹果卷叶蛾(bonagota salubricola meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾)；松色卷蛾属(choristoneura spp.)；条纹向日葵螟(cochylis hospes walsingham)(向日葵细卷叶蛾)；榛小卷蛾(cydia latiferreana walsingham)(榛小卷叶蛾)；苹果蠹蛾(c.pomonella linnaeus或codling moth)；葡萄果实蛾(endopiza viteana clemens)(葡萄浆果蛾)；女贞细卷蛾(eupoecilia ambiguella h
ü
bner)(葡萄蛾)；梨小食心虫(grapholita molesta busck或oriental fruit moth)；鲜食葡萄小卷蛾(lobesia botrana denis&schifferm
ü
ller)(欧洲葡萄藤蛾)；杂色卷叶蛾(platynota flavedana clemens)(色稻纵卷叶蛾)；荷兰石竹小卷蛾(p.stultana walsingham)(杂食卷叶蛾)；苹白小卷蛾(spilonota ocellana denis&schifferm
ü
ller)(苹果芽小卷叶蛾)；和向日葵芽蛾(suleima helianthana riley或sunflowerbud moth)。
[0207]
选择的鳞翅目的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(alsophila pometaria harris)(秋尺蠖幼虫)；桃枝麦蛾(anarsia lineatella zeller或peach twig borer)；橙纹犀额蛾(anisota senatoria j.e.smith)(橙纹橡木虫)；柞蚕(antheraea pernyi gu
é
rin-m
é
neville)(中国橡木蚕蛾)；家蚕(bombyx mori linnaeus)(蚕)；棉潜蛾(bucculatrix thurberiella busck)(棉叶穿孔虫)；纹黄豆粉蝶(colias eurytheme boisduval)(苜蓿毛虫)；胡桃毛虫(datana integerrima grote&robinson或walnut caterpillar)；落叶松毛虫(dendrolimus sibiricus tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾)；白尺蠖(ennomos subsignaria h
ü
bner)(尺蠖)；菩提尺蠖(erannis tiliaria harris)(椴尺蠖)；蔗芽潜蛾(erechthias flavistriata walsingham或sugarcane bud moth)；褐尾蠹(euproctis chrysorrhoea linnaeus)(褐尾蛾)；漂拟龄蛾(harrisina americana gu
é
rin-m
é
neville)(葡萄叶食叶虫)；heliothis subflexa guen
é
e；行列半白大蚕蛾(hemileuca oliviae cockrell)(牧草天蚕蛾)；美国白蛾(hyphantria cunea drury或fallwebworm)；番茄蠹蛾(keiferia lycopersicella walsingham)(番茄蛲虫)；铁杉尺蠖(lambdina fiscellaria fiscellaria hulst或eastern hemlock looper)；西部铁杉尺蠖(l.fiscellaria lugubrosa hulst或westem hemlock looper)；柳毒蛾(leucoma salicis linnaeus)(雪毒蛾)；舞毒蛾(lymantria dispar linnaeus或gypsy moth)；天幕毛虫属(malacosoma spp.)；番茄天蛾(manduca quinquemaculata haworth)(五斑点鹰蛾、番茄天蛾虫)；烟草天蛾(m.sexta haworth)(番茄天蛾虫、烟草天蛾虫)；冬尺蠖蛾(operophtera brumata linnaeus)(松白条尺蠖蛾)；古毒蛾属(orgyia spp.)；尺蠖(paleacrita vernata peck)(春尺蠖)；美洲大芷凤蝶(papilio cresphontes cramer)(巨凤蝶、柑桔凤蝶)；加州橡木虫(phryganidia californica packard或cal而rnia oakworm)；柑橘潜叶蛾(phyllocnistis citrella stainton)(柑桔潜叶蛾)；幕状斑潜蝇(phyllonorycter blancardella fabricius或spotted tentiform leafminer)；欧洲粉蝶(pieris brassicae linnaeus)(大白粉蝶)；小菜粉蝶(p.rapae linnaeus或small white butterfly)；绿纹白粉蝶(p.napi linnaeus或green veined white butterfly)；洋蓟羽蛾
(platyptilia carduidactyla riley或artichoke plume moth)；小菜蛾(plutella xylostella linnaeus或diamondback moth)；棉红铃虫(pectinophora gossypiella saunders或pink bollworm)；纹白蝶(pontia protodice boisduval&leconte)(南方甘蓝虫)；杂食尺蠖(sabulodes aegrotata guen
é
e或omnivorous looper)；红天社娥(schizura concinna j.e.smith)(红背毛虫)；麦蛾(sitotroga cerealella olivier或angoumois grain moth)；松异带蛾(thaumetopoea pityocampa schiffermuller)(松木游牧毛虫)；幕谷蛾(tineola bisselliella hummel)(结网衣蛾)；番茄斑潜蝇(tutaabsoluta meyrick)(番茄潜叶虫)和苹果巢蛾(yponomeuta padella linnaeus)(巢蛾)。
[0208]
感兴趣的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科、豆象科和象甲科的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象虫(anthonomus grandis boheman)(棉子象鼻虫)；密点细枝象(cylindrocopturus adspersus leconte)(向日葵茎象鼻虫)；蔗根非耳象(diaprepes abbreviatus linnaeus)(根象非耳象)；三叶草叶象(hypera punctata fabricius或clover leaf weevil)；稻象甲(lissorhoptrus oryzophilus kuschel)(稻水象甲)；metamasius hemipterus linnaeus(西印度蔗象甲)；蔗丝光象甲(m.hemipterus sericeus olivier或silky cane weevil)；谷象(sitophilus granarius linnaeus或granary weevil)；米象(s.oryzae linnaeus或rice weevil)；红色种子象(smicronyx fulvus leconte)(红色葵花籽象鼻虫)；灰色种子象(s.sordidus leconte)(灰色葵花籽象鼻虫)；玉米象虫(sphenophorus maidis chittenden或maize billbug)；几内亚甘蔗象(rhabdoscelus obscurus boisduval)(新几内亚蔗象鼻虫)；叶甲科中的跳甲、黄瓜叶甲、食根虫、叶甲、薯虫、和潜叶虫，包括但不限于：chaetocnema ectypa horn(沙漠玉米跳甲)；玉米跳甲(c.pulicaria melsheimer或corn flea beetle)；褐斑肖叶甲(colaspis brunnea fabricius)(葡萄肖叶甲)；diabrotica barberi smith&lawrence(北方玉米根虫)；d.undecimpunctata howardi barber(南方玉米根虫)；d.virgifera virgifera leconte(西方玉米根虫)；马铃薯叶甲(leplinotarsa decemlineata say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；橙足负泥虫(oulema melanopus linnaeus)(谷物叶甲)；十字花科条跳甲(phyllotreta cruciferae goeze(玉米跳甲)；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis fabricius或sunflower beetle)；来自瓢虫科的甲虫，包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(epilachna varivestis mulsant或mexican bean beetle)；来自金龟子科的金龟子和其他甲虫，包括但不限于：antitrogus parvulus britton(childers甘蔗蛴螬)；方头甲属(cyclocephala borealis arrow)(北方独角仙、白蛴螬)；c.immaculata olivier(南方独角仙、白蛴螬)；白毛革鳞鳃金龟(dermolepida albohirtum waterhouse)(灰背甘蔗甲虫)；euetheola humilis rugiceps leconte(甘蔗甲虫)；lepidiota frenchi blackbum(法国甘蔗蛴螬)；tomarus gibbosus de geer(胡萝卜金龟)；t.subtropicus blatchley(甘蔗蛴螬)；鳃角金龟属(phyllophaga crinita burmeister)(白蛴螬)；p.latifrons leconte(六月鳃角金龟)；日本丽金龟(popillia japomca newman)(日本甲虫)；欧洲切根鳃金龟(rhizotrogus majalis razoumowsky)(欧洲鳃角金龟)；来自皮蠹科(dermestidae)的皮蠹；来自叩头甲科(elateridae)的铁线虫，伪金针虫属(eleodes spp.)、叩头虫属(melanotus spp.)(包括m.communis gyllenhal(铁线虫))；宽胸叩头虫属(conoderus spp.)；limonius属；叩甲属(agriotes spp.)；clenicera属；aeolus属；来自小蠹科
flavopicta(沫蝉)；柑桔粉虱(dialeurodes citri ashmead或citrus whitefly)；diaphnocoris chlorionis say(皂角蝽)；麦双尾蚜(diuraphis noxia kurdjumov/mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫)；duplachionaspis divergens green(盾蚧)；车前圆尾蚜(dysaphis plantaginea paaserini)(红苹果蚜)；棉红蝽(dysdercus suturellus)(棉红椿)；甘蔗嫡粉介壳虫(dysmicoccus boninsis kuwana)(甘蔗灰粉蚧)；马铃薯小绿叶蝉(empoasca fabae harris)(马铃薯叶蝉)；苹果绵蚜(eriosoma lanigerum hausmann或woolly apple aphid)；erythroneoura属(葡萄叶蝉)；eumetopina flavipes muir(岛上甘蔗飞虱)；扁盾蝽属(eurygaster)；euschistus servus say(褐臭蝽)；e.variolarius palisot de beauvois(斑蝽(one-spotted stink bug))；graptostethus属(种子蝽复合体)；和大尾蚜(hyalopterus pruni geoffroy)(桃大尾蚜)；吹绵蚧(icerya purchasi maskell)(吹绵蚧)；labopidicola allii knight(洋葱盲蝽)；介体灰飞虱(laodelphax striatellus fallen)(小褐飞虱)；leptoglossus corculus say(松树种子缘蝽)；leptodictya tabida herrich-schaeffer(甘蔗网蝽)；萝卜蚜(lipaphis erysimi kaltenbach或turnip aphid)；lygocoris pabulinus linnaeus(苹绿盲蝽)；美洲牧草盲蝽(lygus lineolaris palisot de beauvois)(美国牧草盲蝽)；l.hesperus knight(西部美国牧草盲蝽)；l.pratensis linnaeus(常见牧场盲蝽)；长毛草肓蝽(l.rugulipennis poppius)(欧洲牧草盲蝽)；马铃薯长管蚜(macrosiphum euphorbiae thomas)(马铃薯蚜)；macrosteles quadrilineatus forbes(紫菀叶蝉)；十七年蝉(magicicada septendecim linnaeus)(周期蝉)；mahanarva fimbriolata(甘蔗沫蝉)；高粱蚜(melanaphis sacchari zehnmer或sugarcane aphid)；粉蚧(melanaspis glomerata green)(黑色介壳虫)；麦无网长管蚜(metopolophium dirhodum walker)(蔷薇麦蚜)；桃蚜(myzus persicae sulzer)(桃-马铃薯蚜、绿桃蚜)；莴苣蚜(nasonovia ribisnigri mosley或lettuce aphid)；nephotettix cinticeps uhler(大青叶蝉)；黑尾叶蝉(n.nigropictus)(稻叶蝉)；稻绿蝽(nezara viridula linnaeus)(南方喜绿蝽象)；褐飞虱(nilaparvata lugens或brown planthopper)；小长蝽(nysius ericae schilling)(谷长蝽)；nysius raphanus howard(谷长蝽)；美洲稻蝽(oebalus pugnax fabricius)(美洲稻盾蝽)；乳草长蝽(oncopeltus fasciatus dallas)(大马利筋长蝽)；orthops campestris linnaeus；瘿绵蚜(pemphigus spp.)(根芽和瘿蚜)；玉米蜡蝉(peregrinus maidis ashmead)(菲岛玉米蜡蝉)；甘蔗扁角飞虱(perkinsiella saccharicida kirkaldy)(甘蔗飞虱)；根瘤蚜(phylloxera devastatrix pergande)(山核桃根瘤蚜)；桔臀纹粉蚧(planococcus citri risso)(柑橘粉蚧)；plesiocoris rugicollis fallen(苹果盲蝽)；poecilocapsus lineatus fabricius(四线叶虫)；棉盲蝽(pseudatomoscelis seriatus reuter或cotton fleahopper)；粉蚧属(pseudococcus spp.)(其他水蜡虫复合体)；绵蜡蚧(pulvinaria elongata newstead)(绵草绒蚧)；印度蔗飞虱(pyrilla perpusilla walker)(甘蔗叶蝉)；红蝽属(pyrrhocoridae spp.)；梨圆蚧(quadraspidiotus perniciosus comstock)(圣约瑟虫)；猎蝽属(reduviidae spp.)；玉米蚜(rhopalosiphum maidis fitch)(玉米叶蚜)；禾谷缢管蚜(r.padi linnaeus)(稠李-燕麦蚜)；糖粉蚧(saccharicoccus sacchari cockerell)(甘蔗红粉蚧)；麦二叉蚜(sohizaphis grammum rondani)(绿蚜)；sipha flava forbes(甘蔗黄蚜)；麦长管蚜
(sitobion avenae fabricius)(英国谷粒蚜)；白背飞虱(sogatella furcifera horvath或white-backed planthopper)；纵条飞虱(sogatodes oryzicola muir)(米飞虱)；spanagonicus albofasciatus reuter(白斑盲蝽)；苜蓿斑蚜(therioaphis maculata buckton或spotted alfalfa aphid)；tinidae属；桔二叉蚜(toxoptera aurantii boyer de fonscolombe)(黑色桔二叉蚜)；以及t.citricida kirkaldy(棕色桔二叉蚜)；trialeurodes abutiloneus(带状飞粉虱)和温室白粉虱(t.vaporariorum westwood或greenhouse whitefly)；trioza diospyri ashmead(柿木虱)；以及typhlocyba pomaria mcatee(苹白小叶蝉)。
[0212]
还包括的是壁虱目的成虫和幼虫(螨虫类)，例如aceria tosichella keifer(小麦瘤螨)；苹果红蜘蛛(panonychus ulmi koch)(欧洲红螨)；潜岩螨(petrobia latens m
ü
ller)(麦长腿蜘蛛)；steneotarsonemus bancrofti michael(甘蔗茎螨)；叶螨科(tetranychidae)中的蜘蛛螨和红蜘蛛，oligonychus grypus baker&pritchard、甘蔗小爪螨(o.indicus hirst)(甘蔗叶螨)、草地小爪螨(o.pratensis banks)(班克斯草地螨)、o.stickneyi mcgregor(甘蔗蜘蛛螨)；二斑叶螨(tetranychus urticae koch或two spotted spider mite)；t.mcdanieli mcgregor(麦克丹尼尔螨)；朱砂叶螨(t.cinnabarinus boisduval)(胭脂红蜘蛛螨)；t.turkestani ugarov&nikolski(草莓蜘蛛螨)、在细须螨科(tenuipalpidae)中的平螨、短须螨(brevipalpus lewisi mcgregor)(桔短须螨)；在瘿螨科(eriophyidae)中的锈芽螨、以及其他叶面摄食螨虫和在人类和动物健康中重要的螨虫，即在表皮螨科(epidermoptidae)中的尘螨、在蠕形螨科(demodicidae)中的毛囊蠕形螨、在食甜螨科(glycyphagidae)中的粮食螨、在硬蜱科中的扁虱。肩突硬蜱(ixodes scapularis say)(鹿蜱)；全环硬蜱(i.holocyclus neumann)(澳大利亚致瘫痪埤)；变异革蜱(dermacentor variabilis say)(美洲犬蜱)；美洲钝眼蜱(amblyomma americanum linnaeus)(美洲钝眼蜱)；以及在痒螨科(psoroptidae)、蒲螨科(pyemotidae)和疥螨科(sarcoptidae)中的疥癣和疥螨。
[0213]
感兴趣的是缨尾目中的昆虫有害生物，例如衣鱼(lepisma saccharina linnaeus)(蠹虫)；家衣鱼(thermobia domestica packard或firebrat)。
[0214]
覆盖的其他节肢动物有害生物包括：蜘蛛目(araneae)中的蜘蛛，例如褐隐毒蛛(loxosceles reclusa gertsch&mulaik)(褐皮花蛛)；和黑寡妇蜘蛛(latrodectus mactans fabricius或black widow spider)；和蚰蜒目(scutigeromorpha)中的蜈蚣，例如蚰蜒(scutigeracoleoptrata linnaeus)(家蜈蚣)。另外，等翅目(isoptera)的昆虫有害生物是感兴趣的，包括白蚁科(termitidae)的昆虫有害生物，例如但不限于，cylindrotermes nordenskioeldi holmgren和pseudacanthotermes militaris hagen(甘蔗白蚁)。缨翅目(thysanoptera)的昆虫也是感兴趣的，包括但不限于蓟马，例如stenchaetothrips minutus van deventer(甘蔗蓟马)。
[0215]
可以在早期发育阶段(例如作为幼虫或其他未成熟形式)测试针对昆虫有害生物的实施例的组合物的杀有害生物活性。可以在从约20℃至约30℃和从约30％至约70％相对湿度的完全黑暗中饲养昆虫。生物测定可以如在czapla和朗(lang)(1990)经济昆虫学杂志(j.econ.entomol.)83(6)：2480-2485中描述的进行。饲养昆虫幼虫和进行生物测定的方法是本领域普通技术人员熟知的。
[0216]
各种生物测定技术是本领域技术人员已知的。一般程序包括将实验化合物或生物体添加到封闭容器中的食物来源。杀有害生物活性可以通过但不限于以下各项来测量：在摄食和暴露适当长度的时间之后的死亡率、体重损失、吸引力、排斥性以及其他行为和物理变化的变化。本文所述的生物测定可以用于幼虫或成虫阶段的任何饲养昆虫有害生物。
[0217]
以下实例是以说明的方式而并不是以限制的方式提供的。
[0218]
实验
[0219]
实例1-产生具有改进的杀昆虫活性谱的cry1b变体
[0220]
具有seq id no：1的氨基酸的cry1bd杀昆虫蛋白(us 8,692,065)针对欧洲玉米螟(玉米螟(ostrinia nubilalis))幼虫具有高的杀昆虫活性(ilc50＝1ppm)，但是针对玉米穗蛾(玉米穗虫(helicoverpa zea))和秋粘虫(草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))具有低的杀昆虫活性(ilc50分别为＞1000ppm和约400ppm)。称为具有seq id no：47的氨基酸的cry1b杀昆虫蛋白(称为mp258)(序列号pct/us 14/49923)针对欧洲玉米螟(玉米螟(ostrinia nubilalis))幼虫具有高的杀昆虫活性(ilc50＝4ppm)，但是针对玉米穗蛾(玉米穗虫(helicoverpa zea))和秋粘虫(草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))具有低的杀昆虫活性(ilc50分别为24ppm和62ppm)。设计了一系列来自cry1bd(seq id no：1)和mp258的变体cry1b多肽，从而与cry1bd(seq id no：1)和/或mp258(seq id no：47)相比，改进针对玉米穗蛾(cew)和/或秋粘虫(faw)的杀昆虫活性同时保持ecb杀昆虫活性。产生的具有改进的杀昆虫活性的变体cry1b多肽包括在表1中显示的那些。如实例4中所述确定cry1b变体的杀昆虫活性，并且杀昆虫活性结果在表3中示出。变体cry1b多肽的氨基酸序列比对在图1中示出。
[0221]
表1
[0222]
克隆id多肽多核苷酸crv1bdseq id no：1seq id no：2ip1b-b1seq id no：3seq id no：4ip1b-b21seq id no：5seq id no：6ip1b-b22seq id no：7seq id no：8ip1b-b23seq id no：9seq id no：10ip1b-b24seq id no：11seq id no：12ip1b-b25seq id no：13seq id no：14ip1b-b26seq id no：15seq id no：16ip1b-b27seq id no：17seq id no：18ip1b-b28seq id no：19seq id no：20ip1b-b29seq id no：21seq id no：22ip1b-b31seq id no：23seq id no：24ip1b-b32seq id no：25seq id no：26ip1b-b33seq id no：27seq id no：28ip1b-b34seq id no：29seq id no：30ip1b-b40seq id no：31seq id no：32ip1b-b41seq id no：33seq id no：34
ip1b-b42seq id no：35seq id no：36ip1b-b43seq id no：37seq id no：38ip1b-b44seq id no：39seq id no：40ip1b-b45seq id no：41seq id no：42ip1b-b46seq id no：43seq id no：44ip1b-b47seq id no：45seq id no：46mp258seq id no：47seq id no：48gs060seq id no：49seq id no：50
[0223]
如在尼德尔(needle)程序(emboss工具套件)中执行的，使用内得勒曼-文施算法计算的cry1b变体多肽的百分比氨基酸序列同一性在表2a-2b中作为矩阵表示出。矩阵表的空白部分未示出。
[0224]
表2a
[0225][0226]
表2b
[0227][0228][0229]
实例2-在mp258和ip-1b变体cry1b多肽的选定位置处的饱和诱变
[0230]
编码mp258、ip1b-b21、ip1b-b25和ip1b-b45(分别为seq id no：47、seq id no：5、seq id no：13、和seq id no：41)的seq id no：48、seq id no：6、seq id no：14、和seq id no：42的多核苷酸被用作选定氨基酸位置处的饱和诱变的模板。设计反向诱变引物和互补的正向诱变引物以在感兴趣的一个或多个位点处产生一个或多个希望的氨基酸取代。典型地，诱变引物长度在30至45个碱基之间，其中两个或更多个碱基，通常为10至15个，位于感兴趣位点的两侧。为了进行饱和诱变，使用覆盖所有可能的氨基酸残基的简并引物。使用安捷伦公司(agilent)的quikchange
tm
发光定点诱变(lightening site-directed mutagenesis)试剂盒进行诱变反应。根据制造商使用说明书，试剂盒中提供的材料是quikchange
tm
发光酶(lightening enzyme)、10x quikchange
tm
发光缓冲液、dntp混合物、quiksolution
tm
试剂和don限制性内切酶。
[0231]
典型地使用在含有50-100ng模板、0.4-2μm引物对、200μm dntp和2单位dna聚合酶的50μl的扩增(expand)
tm
高保真pcr系统(罗氏公司(roche)，瑞士)中进行pcr扩增。通过将反应混合物预热至94℃持续3min，随后进行以下循环程序的16个循环来开始诱变反应：在94℃持续1min，在52℃持续1min，并且根据模板的长度在68℃持续8min、12min、16min或24min。通过在68℃下孵育1h来完成诱变反应。通过琼脂糖凝胶电泳评价pcr扩增产物。pcr产物通过qiaquick
tm pcr纯化试剂盒(凯杰公司(qiagen)，德国)来纯化，并且用限制性内切酶dpni进一步处理。典型地，将1μl的pcr产物的等分试样转化到bl21(de3)细胞中并且接种
在含有100μg/ml氨苄青霉素的卢里亚-贝尔塔尼(luria-bertani，lb)平板上。选择约48个或更多个菌落用于饱和诱变，并且分离质粒dna用于测序。使用两步测序，首先用一个测序引物对一个或多个特异性突变位点进行测序，随后用多个测序引物进行全长序列确认。通过测序证实所有19个氨基酸突变后，那些突变基因被推进用于表达和蛋白质纯化。
[0232]
在用于覆盖从t495至e655的整个ip1b-b25结构域iii的突变的情况下，从每个位点挑选48个突变体克隆并且筛选cew活性，如实例4中所述。为了对那些突变体克隆进行测序以确定突变的氨基酸，在经过诱变的151个氨基酸残基中，基于上游突变和下游突变的数量对103个位点进行测序。未对含有未显示显著活性变化的突变体的那些位点进行测序。
[0233]
实例3-变体cry1b杀昆虫蛋白的纯化
[0234]
变体cry1b杀昆虫蛋白基因在修饰的pmal载体(来自新英格兰生物实验室(new england biolabs)的目录号e8000s)中作为与mbp(麦芽糖结合蛋白)的融合物表达。修饰pmal载体以在位置1处的甲硫氨酸之后将6xhis标签附接到mbp的n末端。将含有杀昆虫蛋白基因的质粒克隆到大肠杆菌bl21(de3)中。将bl21细胞在摇床中、在96孔深板或烧瓶中、在magicmedia
tm
(生命技术公司(life technologies))中生长，该摇床以250rpm在37℃下运行8小时，随后在16℃下运行64小时。在16℃孵育期间，mbp-毒素融合蛋白作为可溶性蛋白质积累在bl21细胞中。
[0235]
为了纯化融合蛋白，通过离心收获大肠杆菌细胞，并且将其在由50ml磷酸钠缓冲液(含有300mm nacl、2u/ml内切核酸酶(epicenter公司)和5mm macl2，ph 8)中的2mg/ml溶菌酶组成的溶菌酶溶液中在37℃下温和摇动3小时进行处理。然后用1％triton x100将经溶菌酶处理的大肠杆菌细胞破碎，并且通过以4000rpm、30min(96孔板)或以9000rpm(烧瓶生产的样品)离心制备含有ip-1b蛋白质的透明裂解物。通过亲和层析法，使用来自凯杰(qiagen)
tm
的ninta琼脂糖，按照制造商的标准程序，从透明裂解物中纯化his标记的mbp-毒素蛋白质。对于在96孔板中制备的那些透明裂解物样品，使用pall corporation
tm
(纽约州华盛顿，港湾公园驱动港25号，11050(25harbor park drive port washington，ny 11050))96深孔过滤板作为亲和层析柱。将从ninta琼脂糖洗脱的纯化的毒素蛋白质通过sephadex g25，以便将磷酸盐缓冲液变为25mm hepes-naoh，ph 8，并且用于昆虫生物测定以确定杀昆虫剂。将mbp在25℃下用1/100(w/w)factor xa(新英格兰生物实验室(new england biolabs))消化过夜，并且通过superdex 200柱色谱法利用mbp对superdex的尺寸差异和弱亲和力从ip-1b蛋白质中除去。
[0236]
使用labchip
tm gxii装置(卡尺生物科学公司(caliper lifesciences))通过毛细管电泳确定蛋白质浓度。将蛋白质分析重复至少3次，直到最终浓度在预定的偏差内(小于10％)被认为是可靠的。
[0237]
实例4-变体ip-1b蛋白质的杀昆虫活性的确定
[0238]
cry1b多肽变体针对主要玉米有害生物——欧洲玉米螟(ecb，欧洲玉米螟(ostrinia nubilalis))、玉米穗蛾(ecw，玉米穗虫(helicoverpa zea))和秋粘虫(faw，草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))的活性通过摄食试验来确定，如以下文献描述的：丛(cong，r)等人，苏云金芽孢杆菌生物技术及其对环境的影响的第四届太平洋沿岸会议论文集(proceedings of the 4th pacific rim conferences on biotechnology of bacillus thuringiensis and its environmental impact)，pp.118-123，由阿克赫斯特
(r.j.akhurst)、比尔德(c.e.beard)和休斯(p.hughes)编辑，发表于2002年，堪培拉(canberra)，澳大利亚。简言之，是关于含有杀昆虫蛋白的人工饲料(artificial diet)进行试验。如实例1所描述的制备杀昆虫蛋白，并且将10μl的蛋白质样品与40μl的熔融(40℃-50℃)人工昆虫饲料混合，该饲料是基于用于鳞翅目昆虫配制的南国预混物(southland premix)(南国产品公司(southland products)，阿肯色州湖村(lake village，ar))用低温熔化琼脂糖制备的。将食物-杀昆虫蛋白混合物置于96孔微量滴定板的每个孔中。在28℃下，将一只或多只新生昆虫幼虫置于每个孔中，对于cew和faw饲养4天，并且对于ecb饲养5天。
[0239]
可替代地，使用从联盟生物统计公司(union biometrica)(马萨诸塞州霍利斯顿(holliston，ma))获得的copas
tm
(复杂对象参数分析仪和分选机)，通过大颗粒流式细胞术分选昆虫卵或幼虫，将每孔一个卵或幼虫置于含有固化的人工昆虫饲料的96孔微量滴定板中。当卵被用于放置在试验板中时，只有在16小时后含有孵化的幼虫的那些孔被用于试验数据收集。由于有效的copas分选，通常获得90％至95％的孵化率。在一定饲养期之后，使用基于每个孔中幼虫尺寸和死亡率的0-3数值评分系统对昆虫对蛋白质的响应进行评分。如果没有看到响应(或正常增长)，则给出分数为0。当生长稍微迟缓时，给出分数为1。分数为2意味着幼虫在生长中严重迟缓(接近新生幼虫尺寸)。分数为3意味着孔中所有幼虫死亡。通过将总分(来自每个处理的复制孔的分数的总和)除以总的最高可能分数来计算每个处理的百分比响应(响应(response))。例如，如果一个处理(一个样品、一个剂量)有6个复制孔，总的可能最高分数将为3
×
6＝18。
[0240]
为了鉴定对那些玉米有害生物具有增加的活性水平(显著高于参比(例如野生型)、非突变参比蛋白(例如mp258 seq id no：47)的活性)的变体cry1b多肽。在一个96孔测定板中，与4个剂量的参比蛋白一起测定一定浓度的变体多肽。杀昆虫蛋白的浓度在参比蛋白浓度的4个剂量之内，优选在4个剂量浓度的中间点附近。每个样品板在相当数量的孔(例如在4个单独剂量中的16个孔)中含有参比蛋白。同样在每个板中，包括多达80个突变体蛋白以用于与参比蛋白的活性进行比较。从样品板中，通过多通道移液管挑取来自每个孔的10μl样品，并且分配在每个孔中含有40ul熔融饲料的一个测定板中，并在摇床上混合。将该测定板的制造过程重复多达6次或更多次以产生希望数量的测定板。在食物固化并且冷却至4℃之后，将新生昆虫幼虫置于每个孔中，用有孔的聚酯薄膜(mylar film)密封，并且在恒温培养箱中在28℃下孵育。在一定饲养期之后，将昆虫响应在放大镜下进行评分。使用广义线性模型、二项式反应、概率单位，将s型剂量响应值(响应)转化为线性概率单位剂量响应值。将复制中每种蛋白质的响应相加，并且与活性参比蛋白的概率单位剂量-响应线进行比较，创建一个称为fae(快速活性评价(fast activity evaluation))指南数的新数字。例如，如果突变体蛋白在40ppm下显示某一概率单位值，并且参比蛋白的相同概率单位值的实际剂量为100ppm；那么fae值为2.5(100/40)。这意味着突变体蛋白相比参比蛋白2.5倍更加有效。该测定每次用2种不同剂量的突变体蛋白进行并且重复3次，每个突变体产生6个fae指南数数据点。平均fae指南数被称为fae指数。对于每种蛋白质，进行双侧t检验比较6个fae指南数。邦费罗尼(bonferroni)矫正用于评估p值(新颖蛋白的数量/α)，以确定fae指数是否具有统计学意义。
[0241]
本专利申请中使用的其他筛选方法是高剂量测定(hda)。在该方法中，如上所述将
高浓度(高于ec50)的测试蛋白与具有已知活性水平的相似浓度的一种或多种参比蛋白一起置于昆虫测定板上。该hda经常用于分层筛选以快速消除低活性蛋白质或无活性蛋白质。
[0242]
使用的另一种筛选方法是高通量功能测定(hfa)。该测定类似于fae，但仅使用一个剂量而不是2个剂量。另外hfa，特别是其计算索引的方式与fae相同。因此，hfa指数与fae指数具有相同的意义。
[0243]
在评分方案中具有50％响应的预测点称为ilc50，因为它是生长或摄食抑制和致死响应的组合。为了确定ilc50值，每个处理(一个剂量)重复6次或更多次，通常为24次。cry1b变体的杀昆虫活性在表3中示出。
[0244]
表4显示了与参比多肽mp258(seq id no：47)、ip1b-b21(seq id no：5)、ip1b-b25(seq id no：13)或ip1b-b45(seq id no：41)相比具有增加的活性(fae分数≥1.2)的氨基酸取代的、针对玉米穗蛾的杀昆虫活性。表4显示对应于mp258(seq id no：47)的位置50-651的位置编号和氨基酸；预测的二级结构和指定；溶剂暴露分数；mp258(seq id no：47)、ip1b-b21(seq id no：5)、ip1b-b25(seq id no：13)、ip1b-b45(seq id no：41)、ip1b-b21(seq id no：5)、cry1bd(seq id no：1)、cry1bh(seq id no：52)、和cry1bi(seq id no：54)的氨基酸序列的比对；制成变体的多肽主链；氨基酸取代变体(例如l50r)；以及与对应的多肽主链(mp258-seq id no：47，ip1b-b21-seq id no：5，ip1b-b25-seq id no：13，或ip1b-b45-seq id no：41)相比针对玉米穗蛾的fae杀昆虫分数。
[0245]
表3
[0246][0247][0248]
表5显示了与多肽主链mp258(seq id no：47)、ip1b-b21(seq id no：5)、ip1b-b25(seq id no：13)或ip1b-b45(seq id no：41)相比具有fae分数≤1.2的氨基酸取代的、针对玉米穗蛾的杀昆虫活性。表5显示对应于mp258(seq id no：47)的位置50-651的位置编号和
氨基酸；制成变体的多肽主链；氨基酸取代变体(例如l50r)；以及与对应的多肽主链(mp258-seq id no：47，ip1b-b21-seq id no：5，ip1b-b25-seq id no：13，或ip1b-b45-seq id no：41)相比，针对玉米穗蛾的fae杀昆虫分数。
[0249]
表4
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表5
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[0289]
[0290]
[0291][0292]
实例5-玉蜀黍叶片中的瞬时表达和昆虫生物测定
[0293]
将编码变体cry1b多肽的多核苷酸克隆到在玉蜀黍泛素启动子(克里斯滕森(christensen)和奎尔(quail)，(1996)转基因研究(transgenic research)5：213-218)和重复版本的来自奇异(mirabilis)花叶病毒(dmmv pro；戴伊(dey)和迈蒂(maiti)，(1999)植物分子生物学(plant mol.biol.)，40：771-82)的启动子控制下的瞬时表达载体中。将土壤杆菌细胞悬浮液引入完整组织的植物细胞中这样使得可重复感染和随后的植物来源的转基因表达可以被测量或研究的土壤杆菌浸润方法是本领域熟知的(迦毗罗(kapila)等人(1997)植物科学(plant science)122：101-108)。简言之，将玉蜀黍的幼小植物用测试和对照菌株的标准化细菌细胞培养物进行农杆菌浸润。从每个小植株产生叶盘，并且与适当的对照一起用wcrw(玉米根虫(diabrotica virgifera))侵染。在侵染2天后，对绿叶组织的消耗程度进行评分。
[0294]
实例6-矮菜豆叶中的瞬时表达和昆虫生物测定
[0295]
对于大豆表达，可以设计优化的编码序列。将土壤杆菌细胞悬浮液引入完整组织的植物细胞中这样使得可重复感染和随后的植物来源的转基因表达可以被测量或研究的土壤杆菌浸润方法是本领域熟知的(迦毗罗(kapila)等人(1997)植物科学(plant science)122：101-108)。简言之，将矮菜豆的切除的叶盘用测试和对照菌株的标准化细菌细胞培养物进行农杆菌浸润。4天后，用单独的大豆夜蛾(sbl)(黄豆银纹夜蛾(chrysodeixis includens))、玉米穗蛾(cew)(玉米穗虫(helicoverpa zea))、毛豆毛虫(vbc)(黎豆夜蛾(anticarsia gemmatalis))或秋粘虫(草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))侵染叶盘。对照叶盘是用仅含有dsred2荧光标记的土壤杆菌(clontech
tm
，加利福尼亚州山景城市特拉贝拉大街1290号(94043)(1290terra bella ave.mountain view，ca 94043)表达载体产生的。包括非浸润植物的叶盘作为第二对照。感染后3天对绿叶
组织消耗量进行评分并且给出分数为0至9。
[0296]
实例7-玉蜀黍的土壤杆菌介导的转化和转基因植物的再生
[0297]
对于用本披露的多核苷酸序列进行的玉蜀黍的土壤杆菌介导的转化，可以使用赵(zhao)的方法(美国专利号5,981,840和pct专利公开wo 98/32326；其内容通过引用特此结合)。简言之，从玉蜀黍上分离未成熟胚芽，并且在细菌能够将毒素核苷酸序列转移到至少一个未成熟胚芽的至少一个细胞中的条件下使胚芽接触土壤杆菌的悬浮液(步骤1：侵染步骤)。在该步骤中，可以将未成熟胚芽浸没于土壤杆菌悬浮液中开始接种。将这些胚芽与土壤杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在侵染步骤后，可以在固体培养基上培养未成熟胚芽。在共培养时期后，计划一个任选的“静止”步骤。在这个静止步骤中，胚芽在至少一种抗生素存在下孵育，已知该抗生素不需添加植物转化子的选择剂即可抑制土壤杆菌的生长(步骤3：静止步骤)。未成熟胚芽在具有抗生素但是不含选择性药剂的固体培养基上培养，以消除土壤杆菌并且持续感染细胞的静止阶段。然后，接种的胚芽在含有一种选择剂的培养基上培养，回收生长的转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。未成熟胚芽在具有导致转化细胞的选择性生长的选择性药剂的固体培养基上培养。然后，愈伤组织再生为植物(步骤5：再生步骤)，并且将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上培养再生为植物。
[0298]
实例8-大豆胚芽的转化
[0299]
将大豆胚芽用含有可操作地连接到合适启动子的毒素核苷酸序列进行如下质粒轰击。为了诱导体细胞胚芽，将从适当的大豆栽培种的表面灭菌的未成熟种子上切下的长度为3-5mm的子叶在适当的琼脂培养基上、在26℃下、在光线或暗处培养6至10周。然后切下产生次生胚的体细胞胚，置于一种适当的液体培养基中。在重复筛选扩增为早期球形阶段胚芽的体细胞胚簇后，悬浮液如下所述保持。
[0300]
可以在旋转摇床上在26℃下以150rpm在35ml液体培养基中保持大豆胚性悬浮培养物，以16∶8小时日/夜时间表进行花期光照。通过接种大约35mg的组织到35ml的液体培养基中，将培养物每两周传代培养一次。
[0301]
然后可以通过粒子枪轰击的方法来转化大豆胚性悬浮培养物(克莱因(klein)等人(1987)自然(nature)(伦敦)327：70-73；美国专利号4,945,050)。可以使用杜邦(du pont)biolistic pds1000/he仪(氦改进型)进行这些转化。
[0302]
可以用于促进大豆转化的可选择标记基因包括但不限于：来自花椰菜花叶病毒的35s启动子(奥德尔(odell)等人(1985)自然(nature)313：810-812)，来自质粒pjr225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；gritz等人(1983)基因(gene)25：179-188)和来自根癌土壤杆菌的ti质粒的t dna的胭脂碱合酶基因的3
′
区域。包含可操作地连接到合适的启动子的毒素核苷酸序列(例如seq id no：1、seq id no：3或玉蜀黍优化的序列)的表达盒可以作为限制性片段分离。该片段然后能够插入携带标记基因的载体的独特限制性酶切位点内。
[0303]
向50μl的60mg/ml 1μm的金颗粒悬浮液中(按顺序)添加：5μldna(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1m)、和50μl cacl2(2.5m)。颗粒制剂然后搅拌3分钟，在微量离心机中离心10秒钟，除去上清液。然后，将dna包被的颗粒在400μl 70％乙醇中洗涤一次，并且重悬浮于40μl的无水乙醇中。dna/颗粒悬浮液能够超声处理3次，每次1秒钟。然后将5微升dna包被的金颗粒加到每个巨载体盘上。
[0304]
将大约300-400mg的两周的悬浮培养物置于一个空的60
×
15mm培养皿中，并且用移液管从组织中除去残余的液体。对于每次转化实验，通常轰击约5-10个组织平板。膜破坏压力设置为1100psi，并且将容器抽真空至28英寸汞柱的真空。组织放置在距阻滞筛约3.5英寸处，轰击3次。轰击后，组织可以对半切开，放回液体中，如上所述培养。
[0305]
轰击5至7天后，液体培养基可以更换为新鲜培养基，并且轰击11至12天后可以更换为含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基。该选择性培养基能够每周更新。轰击7-8周后，可以观察到从未转化的坏死胚性簇中生长出转化的绿色组织。取下分离的绿色组织，接种各个摇瓶，产生新的、无性繁殖的、转化的胚性悬浮培养物。每个新系都可以作为独立的转化事件处理。这些悬浮液然后可以传代培养，保持为未成熟胚芽簇，或者通过各个体细胞胚的成熟和萌芽再生为整个植物。
[0306]
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请指示了本披露所属领域技术人员的水平。将所有出版物、专利和专利申请通过引用结合在此，其程度就像明确且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合一样。
[0307]
尽管出于清晰理解的目的已经借助于说明和实例相当详细地描述了前述披露，但显而易见可以在实施例的范围内实践某些变化和修改。