与鸡高温耐受相关的分子标记及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程和遗传育种领域，具体涉及一种与鸡高温耐受相关的分子标记及其应用。


背景技术：

2.在过去几十年里，全球变暖已造成许多地区高温季节时间延长，集约化养殖环境下高温胁迫对家禽健康的影响越来越大。由于禽类体表羽毛丰厚，且全身无汗腺，代谢旺盛，体温高，现代商业家禽由于其快速的新陈代谢会产生更多的体温，使得家禽遭受高温时尤为敏感，轻者生长速度慢，重者导致死亡高温，对家禽养殖业造成巨大的经济损失。据统计，高温对全球家禽行业造成的经济损失每年高达1.28亿至1.65亿美元。那么如何保证家禽在高温环境下具有较高的生产性能和经济效益，是目前家禽养殖比较关注的焦点问题。当前家禽生产中也在不断开展有效的缓解之策，包括采用通风降温、营养调控等措施来应对高温环境下的不适应，其中通过育种手段开发高温耐受家禽品系亦可成为有效且长久的举措之一。
3.国家科技部重点研发计划申报指南提出“聚焦加快破解农业生物遗传基础科学问题，提升设计育种能力，保障国家粮食安全”的目标，并首次将农业生物重要性状与环境适应性的研究要点作为指南内容之一，凸显了国家对生物与环境适应的高度重视。而家禽育种的主要目的就是为了提高家禽的生产性能，然而家禽生产性能的提高必然需要对环境适应能力的提高，尤其是对未来高温环境能有更好的适应性。因而高温耐受被认为是是家禽的一种环境适应能力，通过遗传育种手段培育高温耐受品系是当代家禽育种的方向之一。利用有效的分子标记进行高温耐受的选择，能够有效促进鸡高温耐受品种或品系的培育。目前仅有少数研究报道了可作为鸡高温耐受的潜在遗传标记，主要集中在已知的基因开展工作，对于鸡基因组上更多潜在的分子标记研究尚缺乏。因此定位高温耐受的snp分子标记可获得更快的遗传进展，对推动高温耐受鸡新品系培育的进程具有重要的意义。


技术实现要素：

4.为了解决生产中高温耐受新品系的选育问题，本发明提供了一种与高温耐受相关的snp分子遗传标记，所述的snp标记有助于从遗传水平上改善家禽的高温耐受性，可用于鸡的分子标记辅助选择。
5.为达到上述发明的目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.本发明第一方面提供了一种与鸡高温耐受相关的snp分子标记，所述的snp分子标记位点对应于ncbi上鸡的参考基因组(gallus gallus 5.0)第9号染色体正义链第23059382位、23062420位、23062522位，且所述的3处位点处的碱基分别是g或a、c或t、g或a。
7.较佳地，所述的snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.7所示且第126位碱基是g或a。
8.较佳地，所述的snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.8所示且第120位碱基是c
或t。
9.较佳地，所述的snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.9所示且第96位碱基是c或t。
10.本发明第二方面提供了一种引物组合，所述的引物组合由具有seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5所示核苷酸序列的上游引物和具有seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6所示核苷酸序列的下游引物组成。
11.本发明第三方面提供了一种选育高温耐受的鸡的方法，包括以下步骤：
12.(1)检测一定样本数量的基因组dna中上述的snp分子标记位点的基因型；
13.(2)基于snp位点的基因型对高温耐受鸡进行选择，选择基因型满足3个位点分别为gg、cc、gg鸡，淘汰其他基因型的鸡。
14.较佳地，所述的步骤(1)利用所述的引物组合检测三个snp分子标记的基因型。
15.较佳地，所述的步骤(1)中样本数量为100-1000只。
16.利用本发明的与鸡高温耐受相关的3个snp分子标记进行辅助选择，快速而准确地获得遗传进展；且本发明同时提供了该3个snp分子标记的序列和引物，可建立快速高效精准的分子标记辅助育种选择技术，加快高温耐受鸡品系的选育工作。
附图说明
17.图1a和图1b为鸡基因组上与高温耐受相关的选择信号示意图。
18.图2为受选择信号区域3个snp位点在4个品种中的突变频率示意图。
19.图3为3个snp位点在8个品种群体中的基因型示意图。
20.图4为3个snp位点sanger测序图。
具体实施方式
21.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
22.实施例1
23.选择中国4个不同环境生长的地方品种鸡包括文昌鸡、东乡绿壳蛋鸡、藏鸡和林甸鸡各50只，翅静脉采集2ml血样于edta-na抗凝管中，利用酚-氯仿法进行基因组dna提取。通过dna质控后基于illumina hiseq pe150平台进行全基因组测序。过略掉接头序列(＞10nt与适配器进行校准，允许≤10％的错配)，去除低质量的序列包括≥10％未被识别的核苷酸或者＞50％且碱基测序质量＜5的，去除建库过程中可能产生的pcr重复序列。使用bwa(burrows-wheeler aligner)(0.7.8版本)软件包将剩余的高质量的配对序列用命令mem-t 4-k32 m与鸡参考基因组gallus_gallus-5.0进行匹配分析；同时为了减少测序前pcr扩增产生的错配，通过samtools(0.1.19版本)软件包去除重复的序列。将获得的序列根据gallus_gallus-5.0基因组，使用annovar软件包进行snp和indel注释。
24.选择信号筛选：筛选思路即将高温地区生长的文昌鸡(wcc)、非高温生长地区的绿壳蛋鸡(gsc)和藏鸡(tbc)分别与低温地区生长的林甸鸡(ldc)比较筛选受选择信号，三组信号结合分析，从文昌鸡受选择信号中剔除绿壳蛋鸡、藏鸡两组阴性对照(非高温环境)受选择信号来获得高温受选择信号。筛选方法即通过基于群体分化、以哈温平衡为前提种群遗传学统计方法fst、基于核苷酸多样度的θπratio以及tajima’d相结合的方法定位受选择
信号(见图1)，并分析和筛选受选择信号上与温度适应相关的snp位点(见图2)。用samtools软件包中基于贝叶斯方法在群体中进行snp分析，计算4个品种的每个个体的基因型(见图3)，生长在高温地区品种鸡的三个位点基因型gg、cc、gg的频率高于生长在温带和寒冷地区品种的鸡；进一步统计样本中的等位基因频率(见图2和表1)，结果发现3个snps在文昌鸡上突变频率较低，从绿壳蛋鸡到林甸鸡的突变频率逐渐升高，可能由于家鸡的驯化最初起源于东南亚地区，本身对高温环境有很强的适应性，因此生长在高温地区的鸡这3个位点与家鸡的祖先更为接近，推测这几个snps在高温环境适应中可能发挥作用。
25.表1：4个鸡品种3个snp位点突变频率
[0026][0027]
实施例2
[0028]
为了进一步研究上述3个snp位点的等位基因突变频率模式是否与高温环境适应性相关，试验选取中国其他4个地方品种鸡包括闽清毛脚鸡(mqmc)、广西龙胜凤鸡(lsfc)、山东济宁百日鸡(jnc)和北京油鸡(bjyc)各100只，翅静脉采集2ml血样于edta-na抗凝管中，利用酚-氯仿法进行基因组dna提取。通过dna质控后，对与高温耐受相关的3个snp位点的目的片段进行扩增，3段序列扩增的上下游引物分别为：
[0029]
碱基位于9号染色体第23059382位的引物：
[0030]
上游引物f：cagacagaagaaagagcgggtcag(seq id no.1)
[0031]
下游引物r：actcaccaacacaccaagcctttc(seq id no.2)
[0032]
碱基位于9号染色体第23062420位的引物：
[0033]
上游引物f：gcaggaaccatcgtgtacca(seq id no.3)
[0034]
下游引物r：tcacacagggaacccacaga(seq id no.4)
[0035]
碱基位于9号染色体第23062522位的引物：
[0036]
上游引物f：gtctgtgggttccctgtgtg(seq id no.5)
[0037]
下游引物r：tctgggagatggagattattggc(seq id no.6)
[0038]
pcr扩增：本实施例中试剂来源于北京天根生化科技有限公司，引物合成及测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。以实施例中获得的其他4个品种鸡基因组dna为模板，使用上述引物分别进行pcr扩增。扩增体系如下：
[0039][0040][0041]
pcr反应程序如下：
[0042][0043]
扩增序列的测序与鉴定：
[0044]
上述所扩增的pcr产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行sanger双向测序。将所得的序列与鸡的参考基因组比对，获得对应的snp突变位点。pcr扩增产物如下所示：
[0045]
seq id no.7
[0046][0047]
seq id no.8
[0048][0049]
seq id no.9
[0050][0051]
注意：序列首位加粗的碱基序列为上下游引物序列位置，序列中加粗并标有下划线显示的碱基是突变位点，括号内的为突变碱基且为等位基因突变。
[0052]
由图3可知，随着北京油鸡(bjyc)、济宁白耳鸡(jnc)、闽清毛脚鸡(mqmc)、龙胜凤鸡(lsfc)4个地方品种鸡生长地温度的增加，三个位点基因型gg、cc、gg的频率分别逐渐增加，说明不同品种地方鸡基因型频率与环境温度之间有很强的相关性。进一步分析发现，3个snp位点突变频率龙胜凤鸡《闽清毛脚鸡《济宁白耳鸡《北京油鸡(见表2，具体测序图见图4)，即随着鸡生长环境温度的增加，突变频率变低，进一步认为这3个位点与高温耐受紧密相关。
[0053]
表2 4个鸡品种3个snp位点突变频率
[0054][0055]
实施例3
[0056]
为了进一步探索上述3个snp位点的等位基因突变频率是否适用于高温耐受群体的筛选，试验选择50日龄肉鸡品系a和肉鸡品系b各240只，所有鸡饲喂基础日粮，自由采食。本试验进行循环热应激试验，温度设置为：20:00-00:00、00:00-06:00设置为28℃，06:00-10:00、16:00-20:00设置为32℃，10:00-16:00设置为35℃。试验期为2周。试验第14天，统计其生产性能，并采集血液提取dna后按照实施例2中的3个引物序列和pcr条件扩增后送公司进行sanger测序，检测实施例2中3个snp位点的基因型。
[0057]
结果如表3所示，b组鸡直肠温度、呼吸频率和死亡率均低于a组，推测b组鸡比a组鸡高温耐受性更强；通过测序分析发现b组鸡在3个snp位点的gg、cc、gg基因型频率高，推测在应对高温环境时，b组鸡群体由于具有更好的高温适应性而拥相对较低的死亡率，同时进一步说明3个snp位点在高温耐受群体或品系品种的选择中具有一定的应用价值。
[0058]
表3热应激环境下2组鸡生产性能和3个snp位点突变频率
[0059][0060]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。