一种EPA甘油酯的制备方法与流程

一种epa甘油酯的制备方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种epa甘油酯的制备方法。


背景技术：

2.摄取二十碳五烯酸，可提高身体中epa的浓度，已经证实对治疗高脂血症、冠状动脉心脏病、高血压和炎症有效。此外，epa还被证实能够提高一种治疗严重慢性牛皮癣药物的效果，该牛皮癣药物是低剂量的etretinate 和一种肾上腺皮质激素的混合药物。
3.21世纪初期，国外一系列大规模临床研究发现鱼油中有效成分omega-3 的纯度决定着鱼油产品的疗效，即鱼油中omega-3纯度在85％以上才有临床治疗意义。一篇刊载在国际脂肪酸及脂质研究学会官方期刊《plefa》的临床研究表明，93.5％纯度对比71％纯度的鱼油产品，降低甘油三酯效果提升 5.5倍。而另一篇发表在《柳叶刀》的11324例受试者平均3.5年坚持每日服用1g 90％omega-3高纯深海鱼油的随机多中心研究中得出，每日坚持服用高纯度鱼油的人群相比对照组总死亡率下降20％，心血管疾病死亡率下降 30％，发生猝死的可能性下降45％(摘自the lancet
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vol 354
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august 7, 1999)。
4.日本大洋渔业公司也已经把epa作为一种药物开展研究。在日本，以epa 为原料的保健食品等都已经上市，其中包括人造乳、高浓度epa调味汁、epa 乳化剂等，预计在不久的将来，稳定性高的epa制剂及epa保健品将有一个新的开发高潮。
5.amarin公司开发了一种名为vascepa的高纯度epa药物被批准用于治疗甘油三酯水平高于500毫克/分升的患者，已在美国上市，试验结果显示，与安慰剂相比，服用该药物的患者在主要不良心血管事件中的相对风险降低了25％，给予4克vascepa的患者心血管疾病风险降低25％，包括心脏病发作、中风、动脉阻塞的心脏手术或需要住院治疗的胸痛等，可以为接受标准治疗方案他汀类药物治疗的患者提供良好的低密度脂蛋白胆固醇控制效果，以及心血管风险降低的益处。
6.2004年美国初步批准了一个名为“lovaza”的产品，“lovaza”是一种特别的鱼油脂类调节剂，葛兰素史克药厂研发，主要是epa和dha的组合，表示为降低严重(≥500mg/dl)高甘油三酯血症成年患者甘油三酯(tg) 水平的膳食补充剂。
7.从鱼油中制炼epa、dha有两大发展趋势：其一是精制浓缩天然鱼油(epa 和dha的含量达到30％左右)；其二是采用分离提纯技术获得高纯度epa或 dha单体。目前高纯度epa或dha的产业化采用先乙酯化、再分离提纯的方法，纯度可高达90％，这类化学方法生产技术，存在一定不安全风险与环境污染问题，颇受诟病，生产企业普遍使用乙醇与鱼油先进行酯交换，然后再通过尿素包合法与分子蒸馏进行提纯，由于使用乙醇必须采用防爆车间，存在安全隐患与环境污染问题，分子蒸馏提纯过程也存在温度高、容易产生危害性副产物的风险，因此开发绿色环保的高纯度epa、dha生产技术非常具有积极意义。
8.近几年酶法制备epa甘油酯、dha甘油酯也受到广泛关注，但目前都是采用乙醇与鱼油进行酯交换，再将脂肪酸乙酯进行尿素包合法或分子蒸馏进行分离提纯，然后以高纯度的脂肪酸乙酯与甘油进行酶法酯交换生产高纯度 epa甘油酯、dha甘油酯，因此生产工厂
必需配置乙醇循环回收系统，生产工艺较为复杂，而且分子蒸馏设备一般产能较小，还要采用多级(7级或更多)分子蒸馏才可以将epa含量提高到90％以上，从而导致能耗高，流程设备多，成本居高不下，生产效率低，难以实现大规模生产。
9.epa作为药品和高级营养品,人们对于其纯度以及食品安全性提出愈来越高的需求，为此本领域的科研人员在积极研究各种提取、分离、纯化epa 的技术，以期开发绿色环保的高纯度epa或dha单体产品，满足市场需求。
10.总之，高纯度epa、dha的制备关键技术正处于快速发展时期，尤其是高纯度e医药原料级epa需求呈旺盛，高纯度epa甘油酯是未来的发展确实。


技术实现要素：

11.有鉴于此，本发明旨在提出一种反应条件温和、副反应产物少、成本低、可循环的epa甘油酯的制备方法。
12.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
13.一种epa甘油酯的制备方法，包括以下步骤：
14.s1：脂肪酶法水解鱼油，得到鱼油脂肪酸；
15.s2：将鱼油脂肪酸通过三个轮次冷冻结晶得到分离液，分离液中富含epa 和dha；
16.s3：将分离液经过分子蒸馏，得到epa及dha；优选地，分子蒸馏包括两级，第一级分子蒸馏中塔底产物富含dha，馏出物富含epa，对馏出物进行第二次分子蒸馏，馏出物为高纯度epa，塔底产物富含dha。
17.进一步地，还包括以下步骤：
18.s4：在真空条件下将epa与甘油混合后，加入脂肪酶，搅拌，进行酯化反应得到含有epa甘油酯的粗产物，依照目标产物epa甘油三酯、epa甘油二酯含量可以调整epa与甘油的比例。此外，还可添加少量的过量脂肪酸，在目标产物允许含有单双甘油酯的情况下，也可不添加过量脂肪酸。
19.进一步地，步骤s4中加入的脂肪酶包括嗜热丝孢菌、南极假丝酵母、米黑根毛霉、嗜热丝孢菌，脂肪酶的加入量为epa质量的0.1～5％。
20.进一步地，步骤s4中酯化反应的温度为25～90℃。
21.进一步地，还包括以下步骤：
22.s5：将粗产物依次经过酸化水洗、吸附脱色、脱嗅，得到所需epa甘油酯。
23.进一步地，步骤s1的具体操作方法如下：
24.将水、鱼油、脂肪酶放入水解反应器内，在轴流式搅拌条件下，调节ph 至1.5-10，反应温度为25-90℃，反应时间为12-96h，反应过程中通过循环回路设置的分离器，渐进式分离反应副产物甜水，并向反应器补充水以及新鲜的脂肪酶，以便维持反应器液位，反应主产物为鱼油脂肪酸，持续反应直到水解度达到95％以上。
25.进一步地，步骤s1中使用的脂肪酶包括米根霉、里氏木霉、黑曲霉、白地霉中的至少一种，也可以选择本领域其他水解脂肪酶。
26.进一步地，步骤s2中第一轮次冷冻结晶温度为15～75℃，第二轮次冷冻结晶温度为0～15℃，第三轮次冷冻结晶温度为:-15～0℃。
27.进一步地，步骤s3得到的epa纯度≥90％，dha纯度≥50％。
28.进一步地，还包括以下步骤：
29.s6：在真空的条件下，将dha与甘油混合后，加入脂肪酶，搅拌，进行酯化反应得到粗dha甘油酯，将所述粗dha甘油酯依次经过酸化水洗、吸附脱色、脱嗅，得到dha甘油酯。
30.相对于现有技术，本发明所述的epa甘油酯的制备方法具有以下优势：
31.(1)本发明所述的epa甘油酯的制备方法利用脂肪酶催化水解鱼油，再通过冷冻结晶分离富集epa、dha，然后通过分子蒸馏分离提纯得到高纯度的epa，副产物为高纯度dha，然后分别经过脂肪酶催化合成高纯度的epa 甘油酯、高纯度dha甘油酯，反应条件温和，副反应少，产品安全性更高，而且副产物可以循环利用，环境污染少，生产过程安全风险低，制备工艺简单，成本低；
32.(2)本发明所述的epa甘油酯的制备方法可保留油脂本身的抗氧化成分，从而有效防止多不饱和脂肪酸被氧化，不仅提高产品收率，而且能够提高产品质量。
附图说明
33.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
34.图1为本发明实施例所述的epa甘油酯的制备方法的工艺流程示意图。
具体实施方式
35.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
36.下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
37.实施例1
38.本实施例中epa甘油酯的制备方法，包括如下步骤：
39.(1)鱼油酶法水解：向水解反应器内注入水、鳀鱼油、水解脂肪酶(来源于里氏木霉)，反应起始阶段先调节ph值为7，在轴流搅拌的条件下进行反应，反应温度为55℃，反应时间为72h，得到鱼油脂肪酸和甜水；
40.(2)分离提纯epa和dha：将所述的鱼油脂肪酸依次经过三轮次冷冻结晶分离，再二级分子蒸馏进一步提纯，分别得到高纯度的epa与dha，第一级分子蒸馏高纯度的dha为塔底组分，epa为馏出物，epa馏出物再进行一次分子蒸馏，提纯后的epa的纯度达到95％，提纯后的dha的纯度为80％；
41.(3)高纯度epa甘油酯酶法合成：在真空的条件下，将提纯后的epa 和与甘油按照9:1的比例混合，加入脂肪酶，脂肪酶添加量为epa质量的 0.5％，在65℃、轴流式搅拌条件下进行酯化反应，得到粗epa甘油酯，将所述的粗epa甘油酯依次经过酸化水洗、吸附脱色、脱嗅，得到高纯度的epa 甘油酯；
42.(4)高纯度dha甘油酯酶法合成：在真空的条件下，将提纯后的dha 和甘油按照10:1的比例混合，再加入脂肪酶，脂肪酶添加量为dha质量的 0.3％，在65℃、搅拌下进行酯化反应，得到粗dha甘油酯，将所述的粗dha 甘油酯依次经过酸化水洗、吸附脱色、脱嗅处理，得到高纯度的dha甘油酯；
43.步骤(3)和步骤(4)，采用分子筛吸附剂促进降低水分，以便合成反应进行更彻底，添加硅凝胶、活性白土吸附脱色，然后经过滤再送去脱嗅。 epa甘油酯的纯度为91％，dha甘油酯的纯度为80％。
44.实施例2
45.(1)鱼油酶法水解：向水解反应器内注入水、沙丁鱼油、水解酶(来源于黑曲霉)，搅拌，反应起始阶段，添加磷酸调节ph值为5.6，在搅拌下进行水解反应，反应温度为25℃，反应时间为96h，得到鱼油脂肪酸和甜水，反应过程采用旁路循环以沉降方式分离甜水，并向反应器补充水与酶；
46.(2)分离提纯epa和dha：将所述的鱼油脂肪酸依次经三轮次冷冻结晶分离，再二级分子蒸馏进一步提纯，分别得到高纯度的epa与dha，第一级分子蒸馏高纯度的dha为塔底组分，epa为馏出物，epa馏出物再进行一次分子蒸馏，提纯后的epa的纯度为94.5％，提纯后的dha的纯度为79.3％；
47.(3)高纯度epa甘油酯酶法合成：在真空的条件下，将提纯后的epa 与甘油按照8.5:1的比例混合，再加入脂肪酶，脂肪酶添加量为epa质量的 0.3％，在45℃条件下进行酯化反应，反应过程采用循环喷淋方式，以便让水份快速蒸发，得到粗epa甘油酯，将所述的粗epa甘油酯依次经过酸化水洗、吸附脱色、脱嗅，得到高纯度的epa甘油酯；
48.(4)高纯度dha甘油酯酶法合成：在真空的条件下，将提纯后的dha 和甘油按照9:1比例混合，再加入脂肪酶，脂肪酶添加量为dha质量的0.5％，在65℃条件下进行酯化反应，反应过程采用循环喷淋方式，以便让水份快速蒸发，得到粗dha甘油酯，将所述的粗dha甘油酯依次经过酸化水洗、吸附、脱色、脱嗅处理，得到高纯度的dha甘油酯；
49.epa甘油酯、dha甘油酯分别采用硅凝胶与中性脱色白土、活性炭于真空下进行吸附脱色，然后经过滤再送去脱嗅。epa甘油酯纯度为93％，dha 甘油酯纯度为78.5％。
50.实施例3
51.(1)鱼油酶法水解：向水解反应器内注入水、沙丁鱼油、水解酶(来源于米根霉，初始添加量为鱼油质量的2％)，水与油的质量比为1:1，添加缓冲剂调节ph值为6.0～9.0，在搅拌的条件下进行反应，反应温度为30℃，反应时间为96h，得到鱼油脂肪酸和甜水，通过旁路循环采用离心机分离甜水，反应过程向反应器补加水与脂肪酶；
52.(2)分离提纯epa和dha：将所述的鱼油脂肪酸依次三轮次冷冻结晶分离，再二级分子蒸馏进一步提纯，分别得到高纯度的epa与dha，第一级分子蒸馏高纯度的dha为塔底组分，epa为馏出物，epa馏出物再进行一次分子蒸馏，提纯后的epa的纯度为97％，提纯后的dha的纯度为91％。
53.(3)脂肪酶合成方法与实施例2相同。
54.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。