球孢白僵菌Bb1003及其介导合成纳米银的方法

球孢白僵菌bb1003及其介导合成纳米银的方法
技术领域
1.本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种利用球孢白僵菌合成纳米银的方法。


背景技术：

2.纳米材料是指其组成单元在三维空间中至少有一维尺寸介于1nm-100 nm范围之间的材料。纳米银是指晶粒金属银尺寸为1-100nm。近年来，因其小尺寸而赋予的独特的化学、物理和生物学特性，在各个领域如生物医学、光学、磁学、农业及环境等均有广泛应用。
3.人类对银的认识已有4000多年的历史。银是一种重要的贵金属，在自然界中有单质存在，但绝大部分是以化合态的形式存在于银矿石中。银的理化性质均较为稳定，导热、导电性能很好，质软，富延展性，其反光率极高，可达99%以上，有许多重要用途。随着纳米技术的飞速发展，纳米级银单质展现出独特的物理化学性质及生物学性质，成为最具发展潜力的纳米材料之一。
4.目前纳米银的合成主要采取传统的合成方法包括物理法和化学法，但随着工业上对纳米银的需求的增加，传统的合成纳米银的技术也逐渐暴露出其缺陷。物理法利用物理法生产银纳米材料和金纳米材料，虽然具有反应原理简单，获得产物杂质少、纯度高等优点，但其缺点也十分明显，首先其所需要求较为苛刻，生产成本昂贵，且获得产品较为单一。化学法是一种需要较多还原剂的方法，这些还原剂不仅具有较强的毒性，并且价格昂贵，对环境造成的污染严重。随着绿色化学概念的提出，纳米银的合成方法也需向着经济、简便、高效、绿色无毒、环保节能的方向发展。因此生物法作为一种近年来新兴的合成纳米粒子的方法，越来越受到大家的关注。由于微生物具有分布广、易培养、繁殖快等优点，作为天然的生物材料用于纳米银的胞内或胞外可控合成研究具有极大的潜力。截至目前，已有研究表明自然界中包括原核生物和真核生物在内的多种微生物都可合成纳米银，如细菌、酵母和真菌等，它们都具有在细胞内或者细胞外合成纳米银的能力。


技术实现要素：

5.本发明提供一株球孢白僵菌bb1003及其介导合成纳米银的方法，其目的在于符合绿色发展原则，低成本、高效快速、无毒污染、绿色环保的合成纳米银。
6.本发明是通过如下技术方案实现的。
7.本发明的球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株，于2021年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.23269，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
8.本发明的球孢白僵菌bb1003是从山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户偶然发现的僵蚕中分离得到。该菌株接种在产孢培养基中，接种后置于温度为26
±
1℃、全黑暗、相对湿度为75
±
5%的恒温培养箱中培养；5d后在光学显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态，菌落颜色为乳白色，菌落底端为淡黄色，菌落边缘薄，中间厚，中间有褶皱，菌落呈
同心圆生长（图1）。在光学显微镜下观察，发现产孢细胞单生，很少簇生；产孢轴纤细，膝状弯曲，具小齿突；菌丝透明有隔，隔附近有分支（图2）。分生孢子透明、光滑、呈卵圆或椭圆形（图3）。采用16srdna序列同源性比对，并绘制系统发育树，如图2所示，结果表明：该菌株与数据库中其他球孢白僵菌株聚为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。综合形态特征鉴定和its序列相似性分析，将该菌株命名为球孢白僵菌bb1003。
9.利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米银的方法，包括如下步骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到活化培养基中，在28~30℃下活化培养2~5天，备用；（2）制备发酵液：将步骤（1）制备的活化菌种接种到发酵培养基中,在28~30℃、150~180rpm 下发酵培养4~7天，然后将发酵液在转速为4000rpm下离心30min，用滤纸过滤收集上清液，备用；（3）合成纳米银：将步骤（2）制备的发酵液的上清液作为反应基质，加入1~4 mmol/l的硝酸银溶液，在ph4~9的条件下反应2~24h，然后在离心条件为10000rpm，离心10~30min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 中烘干过夜，得到的粉末即为纳米银。
10.所述活化培养基为pda马铃薯固体培养基。
11.所述活化培养的温度优选为28℃，时间优选为3~4天。
12.所述发酵培养基为pdb马铃薯液体培养基。
13.所述发酵培养优选在恒温震荡培养箱中进行，温度优选为30℃、转速优选160rpm，时间优选5~6天。
14.本发明提供的球孢白僵菌bb1003及其介导合成纳米银的方法，符合绿色发展原则，可低成本、高效快速、无毒污染、绿色环保的合成纳米银。
15.本发明球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株生物合成纳米银的相关试验1、菌株的分离鉴定和分子生物学鉴定（1）菌株的分离鉴定本发明的球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株分离自山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户偶然发现的僵蚕中。采用浓度梯度稀释法从自然感染球孢白僵菌的家蚕中分离纯化球孢白僵菌菌株。具体操作步骤：在超净工作台将上述白僵蚕用无菌钵杵在无菌研钵中研磨，充分研磨后，得到粉碎虫体；称取白僵蚕粉末 0.1g，在超净工作台中，加少量1%的吐温-80的无菌水继续研磨，充分研磨后配制成 10ml 原液，配成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
。取各级稀释液100μl涂布于培养基上于温度为26
±
1℃、全黑暗、相对湿度为75
±
5%的恒温培养箱中培养，进行单孢子培养。待单孢子形成菌落后，挑取各单孢子菌落上的孢子，分别转接至新的培养基上进行培养，至目测和镜检确定平板上长出的菌落形态特征一致，得到纯种菌体，置于4℃冰箱保存备用。用接种环挑取分离纯化后的菌株接种在产孢培养基中，接种后置于温度为26
±
1℃、全黑暗、相对湿度为75
±
5%的恒温培养箱中培养；5d后在光学显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10d后挑取
成熟分生孢子观察分生孢子的形态与大小。在光学显微镜下观察，发现产孢细胞单生，很少簇生；产孢轴纤细，膝状弯曲，具小齿突，菌丝透明有隔，隔附近有分支（图2）。分生孢子透明、光滑、呈卵圆或椭圆形（图3）。
16.（2）菌株分子生物学鉴定取20mg干燥的分离纯化的球孢白僵菌菌体，用液氮充分研磨成粉末，然后用生工生物工程(上海) 股份有限公司的真菌基因组 dna 快速抽提试剂盒提取 dna。采用真菌核糖体 rdna 区通用引物 its1 ( 5'-tccgtaggtga
‑ꢀ
acctgcgg-3') 和 its4( 5'-tcctccgctta ttgat
‑ꢀ
atg c-3')，克隆菌株包含 its1-5.8s-its2 的全序列以及和部分 18s 和 28s rdna 在内的片段。
17.pcr反应体系25μl包括：1μl模板dna，7μl taq plus dna polymerase（5u/μl），0.5μl 50mm mgso4，2.5μl 10
×
pcr buffer，2.5μl dntp (each 10mm)，引物its1（5'-tccgtaggt gaacct gcgg3'，sqe id no.3）/its4（5'-tcctccgcttattga tatgc-3'，sqe id no.4）各1μl（20μmol/l），ddh2o 9.5μl。
18.反应条件：95℃变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸90s；进行30个循环，72℃修复延伸10min。
19.用1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒纯化回收后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
20.将所测得的 rdna its 序列提交 genbank 网站，并使用blast软件，将测得的序列与 genbank 数据库进行比对。取供试菌株和 genbank 数据库中与其序列相似的菌株，用mega 7.0 软件的最大似然法( maximum likelihood，ml) 构建基于部分18s rdna-its1-5. 8s-its2、部分 28s rdna 序列的系统发育树。图4为球孢白僵菌bb1003的系统发育树。
21.菌株bb1003的its序列为：attcgaggtcacgttcagaagttgggtgttttacggcgtggccgcgtcggggtcccggtgcgagctgtattactgcgcagaggtcgccgcggacgggccgccactccatttcagggccggcggtgtgctgccggtccccaacgccgacctccccaaggggaggtcgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatgctggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactggattctgcaattcacattacttatcgcgtttcgctgcgttcttcatcgatgccagagccaagagatccgttgttgaaagttttgattcatttgttttgccttgcggcgtattcagaagatgctggaatacaagagtttgaggtccccggcgggccgctggtccagtccgcgtccgggctggggcgagtccgccgaagcaacgataggtaggtcaca采用16srdna序列同源性比对，该菌株与数据库中其他球孢白僵菌株聚为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。综合形态特征鉴定和its序列相似性分析，将该菌株命名为球孢白僵菌bb1003。
22.、影响球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株合成纳米银因素的试验（1）硝酸银浓度与反应时间对合成纳米银的影响
①ꢀ
活化菌种：用接种环挑取一株4℃保存的球孢白僵菌bb1003斜面菌种划线接种于马铃薯固体培养基(pda)上，在30℃下倒置培养5d以活化菌种。
23.②ꢀ
制备发酵液：将活化好的菌株于超净台中接种到250ml的含有100ml pdb液体培养基的三角瓶中，在30℃、160 rpm下振荡培养4d，得到发酵液。将发酵液在转速为4000rpm下离心30min，用滤纸过滤收集上清液。
24.③ꢀ
合成纳米银：将制备的发酵液的上清液作为反应基质，加入硝酸银溶液,使银离子浓度分别为0.5mmol/l、1.0mmol/l、2.0mmol/l、4.0mmol/l、8.0mmol/l，调节ph为3、4、7、9，在30℃下避光反应24h。合成过程中观察反应液的颜色变化，用紫外-可见分光光度计分别于0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h对反应液进行全波长扫描,检测范围为300~800nm,扫描间隔为0.5nm，将5组反应液的全波长扫描结果进行比较。结果如图5-11所示。
25.由图5-11可知球孢白僵菌菌株的发酵液与 agno
3 溶液混合反应 2h，已开始有纳米银合成，这充分说明利用球孢白僵菌菌株的发酵液可以生物合成纳米银。并且随着反应时间的延长，合成纳米银的峰值逐渐增高，说明合成的纳米银随着反应时间的延长而产量逐渐增多。在 16h 可见峰值明显高2h，说明已合成大量纳米银。且硝酸银浓度为2mmol/l时，峰值每时每刻都高于其他浓度，因此确定 2.0mmol/l的 agno
3 溶液，最适合纳米银的合成。
26.（2）ph值对合成纳米银的影响
①
、
②
两步骤同（1）硝酸银浓度与反应时间对合成纳米银的影响。
27.③ꢀ
纳米银的合成：向步骤b中制备的球孢白僵菌bb1003上清液中加入银离子，使银离子浓度为2.0mmol l，分别调节ph值为3、4、7、9，在30℃下避光反应16h。合成过程中观察最终反应液的颜色变化，用紫外-可见分光光度计对反应液进行全波长扫描，检测范围为300~800nm，扫描间隔为0.5nm，将4组反应液的全波长扫描结果进行比较，结果见图12。由图12可知， ph 值为3时未出现峰值，说明未合成纳米银；ph 为4时出峰，说明合成纳米银；ph 为7时，峰值介于ph=4和ph=9之间，合成效率要高于酸性条件低于碱性条件；ph 为 9 时，纳米银的合成效率最大，峰值最高。图13为不同ph反应条件下反应16h后的颜色变化，图从左至右ph依次为3、4、7、9，颜色表现为随ph的增加，颜色逐步变深。综合上面的实验结果，可以说明 ph 为碱性时相对适合纳米银的合成。
28.（3）球孢白僵菌生物法合成纳米银的稳定性实验将合成的纳米银室温 25
°
c避光放置30d。然后肉眼观察，纳米银分散性较好，没有出现沉淀，颜色没有明显的改变，紫外全波长扫描检测结果如图14，说明该菌生物法合成的纳米银稳定性良好。
29.（4）纳米银的x射线粉末衍射（xrd）表征分析将合成的纳米银粉末烘干后研磨成粉末进行xrd检测分析，条件为以cuk
ɑ
为辐射源（λ=1 .54056
ꢀå
）；cu靶x光管电压≤40 kv、电流≤40 ma；2θ角扫描范围为5
°
~ 90
°
。根据对纳米银的tem图（图15）和xrd图谱（图16）进行分析，在与jcpds标准卡对照后，发现2θ在38.136
°
、46.175
°
、64.356
°
和77.068
°
处，出现的四个衍射峰均为银的特征衍射峰。说明纳米银晶体有四个晶面，分别对应（111）、（200）、（220）和（311）晶面，属于多晶结构。
30.（5）傅里叶变换红外（ftir）光谱表征分析将合成的纳米银粉末与溴化钾按1: 100比例混合、研磨均匀，压片后置于红外光谱仪中进行检测分析。条件为中红外分束器：4000~500 cm-1
；溴化钾分光光束分辨率为0 .4 cm-1
；检测器为dtgs；信噪比为11000:1。如图17所示，纳米银的ftir光谱图在波长范围为4000~500 cm-1
存在一些明显的吸收峰，它们由不同类型的化学键的伸缩振动而引起。3260.66 cm-1 处的振动峰来自于可能介导银离子还原为纳米银的-o-h；1566 .35 cm-1
和1734 .40 cm-1
处的振动峰分别来自于蛋白质酰胺i和酰胺ii中酰胺键的-n-h和-c=o。这表
明由球孢白僵菌bb1003菌体分泌的生物活性组分（如蛋白质）可能在银离子的还原过程中发挥关键作用，而且还可能包覆于形成的纳米银颗粒表面，在防止其团聚的同时还赋予其独特的生物学特性。
31.（6）纳米银的抗菌性能试验受试菌种的活化：受试菌种选择大肠杆菌菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。将保存于4℃斜面的3种受试菌接种至lb液体培养基中振荡培养24 h以活化菌种。
32.抑菌圈试验：采用牛津杯抑菌法测试纳米银对于致病菌的抑菌活性。将3株致病菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）于超净台分别接种于100ml lb液体培养基中37℃160rpm摇床培养24h后，分别移取100
µ
l的菌液均匀涂布于lb固体培养基上，将已灭菌的牛津杯放置于培养基上，每个牛津杯中加入50
µ
l浓度为500mg/l的纳米银溶液，对照为球孢白僵菌发酵液，试验重复3次测量抑菌圈，计算平均值，结果见图18-23分解和表1。
33.由图18-23和表1可知，利用本发明球孢白僵菌bb1003合成的纳米银对多种致病菌有抑制作用，对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）均表现出良好的抑菌效果。
34.最小抑菌浓度( mic) 测定：采用试管稀释法测试制备所得的纳米银对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌这三种菌的最小抑菌浓度。配制不同浓度的纳米银溶液，在每个试管中加入lb液体培养基 3 ml，纳米银的最终浓度为50、100、300、500、1000 mg /l。然后分别在每个试管内加入试验菌悬液 10
µ
l，振荡均匀，置于 37℃ 恒温摇床中培养 24 h。同时设不加试验菌的阴性对照和加菌不加纳米银的阳性对照。结果判定，以试管内肉眼未见细菌生长的最低抗菌剂浓度为 mic 值。结果如表2，本发明制备的纳米银对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的 mbc 值分别为 300、300 和 500 mg /l。
35.本发明的有益效果在于：（1）本发明公开了可生物合成了纳米银的球孢白僵菌
bb1003菌株。（2）本发明公开了利用球孢白僵菌bb1003菌株生物合成了纳米银的方法，该方法操作简便、绿色无毒、环保节能。（3）本发明扩展了真菌在纳米材料绿色合成中的应用，为纳米银的生物合成提供一种新的微生物资源,在生物合成纳米材料领域尤其是绿色合成纳米银领域中具有重要的应用价值。（4）本发明合成的纳米银对多种致病菌有抑制作用，对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）均表现出良好的抑菌效果。
附图说明
36.图1是本发明球孢白僵菌bb1003的菌落形态图。
37.图2是本发明球孢白僵菌bb1003的菌丝形态图。
38.图3是本发明球孢白僵菌bb1003的孢子形态图。
39.图4是本发明球孢白僵菌bb1003的系统发育树。
40.图5是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液与不同浓度硝酸银反应0.5h时合成纳米银的紫外吸收光谱图。
41.图6是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液与不同浓度硝酸银反应1h时合成纳米银的紫外吸收光谱图。
42.图7是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液与不同浓度硝酸银反应2h时合成纳米银的紫外吸收光谱图。
43.图8是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液与不同浓度硝酸银反应4h时合成纳米银的紫外吸收光谱图。
44.图9是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液与不同浓度硝酸银反应8h时合成纳米银的紫外吸收光谱图。
45.图10是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液与不同浓度硝酸银反应16h时合成纳米银的紫外吸收光谱图。
46.图11是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液与不同浓度硝酸银反应24h时合成纳米银的紫外吸收光谱图。
47.图12是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液在不同ph条件下合成纳米银的紫外吸收光谱图。
48.图13是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液在不同ph反应条件下的颜色变化。
49.图14是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米银放置16h和 30d后的紫外吸收光谱图。
50.图15本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米银的tem图。
51.图16是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米银的xrd图。
52.图17是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米银的ftir光谱图。
53.图18是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米银对大肠杆菌的抑菌效果图。
54.图19是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液对大肠杆菌的抑菌对照图。
55.图20是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米银对枯草芽孢杆
菌的抑菌效果图。
56.图21是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌对照图。
57.图22是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米银对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图。
58.图23是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌对照图。
具体实施方式
59.下面结合实施例对本发明作进一步阐述。
60.实施例1本发明的球孢白僵菌bb1003是从山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户偶然发现的僵蚕中分离得到。采用16srdna序列同源性比对，鉴定为beauveria bassiana。该菌株于2021年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.23269，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
61.实施例2利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米银的方法，包括如下步骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到活化培养基中，在28℃下活化培养5天，备用；（2）制备发酵液：将步骤（1）制备的活化菌种接种到发酵培养基中,在28℃、180rpm 下发酵培养4天，然后将发酵液在转速为4000rpm下离心30min，用滤纸过滤收集上清液，备用；（3）合成纳米银：将步骤（2）制备的发酵液的上清液作为反应基质，加入4 mmol/l的硝酸银溶液，在ph7的条件下反应24h，然后在离心条件为10000rpm，离心20min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 中烘干过夜，得到的粉末即为纳米银。
62.实施例3利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米银的方法，包括如下步骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到活化培养基中，在30℃下活化培养2天，备用；（2）制备发酵液：将步骤（1）制备的活化菌种接种到发酵培养基中，在30℃、150rpm 下发酵培养7天，然后将发酵液在转速为4000rpm下离心30min，用滤纸过滤收集上清液，备用；（3）合成纳米银：将步骤（2）制备的发酵液的上清液作为反应基质，加入1 mmol/l的硝酸银溶液，在ph9的条件下反应2h，然后在离心条件为10000rpm，离心20min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 中烘干过夜，得到的粉末即为纳米银。
63.实施例4利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米银的方法，包括如下步
骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到活化培养基中，在29℃下活化培养3天，备用；（2）制备发酵液：将步骤（1）制备的活化菌种接种到发酵培养基中，在29℃、160rpm 下发酵培养5天，然后将发酵液在转速为4000rpm下离心30min，用滤纸过滤收集上清液，备用；（3）合成纳米银：将步骤（2）制备的发酵液的上清液作为反应基质，加入2 mmol/l的硝酸银溶液，在ph8的条件下反应12h，然后在离心条件为10000rpm，离心20min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 中烘干过夜，得到的粉末即为纳米银。
64.实施例5利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米银的方法，包括如下步骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到活化培养基中，在28℃下活化培养4天，备用；（2）制备发酵液：将步骤（1）制备的活化菌种接种到发酵培养基中,在30℃、1700rpm 下发酵培养6天，然后将发酵液在转速为4000rpm下离心30min，用滤纸过滤收集上清液，备用；（3）合成纳米银：将步骤（2）制备的发酵液的上清液作为反应基质，加入3 mmol/l的硝酸银溶液，在ph9的条件下反应8h，然后在离心条件为10000rpm，离心20min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 中烘干过夜，得到的粉末即为纳米银。