一种DC瘤苗及其制备的药物组合物的制作方法

一种dc瘤苗及其制备的药物组合物
技术领域
1.本发明涉及生物领域，更具体的，涉及一种dc瘤苗及其制备的药物组合物。


背景技术：

2.cldjv18.2基因位于人染色体3q22位点。cldn18.2由261个氨基酸组成，为四次跨膜结构，相对分子质量277不大，其氨基端和羧基端均位于细胞膜内侧。cldn18.2有2个胞外环结构域，胞外环1是由53个氨基酸构成的4个反向折叠的3片层结构，其中β3与β4之间存在2个高度保守的半胱氨酸，它们之间形成的二硫键有助于分子结构的稳定；胞外环2由31个氨基酸组成，位于跨膜区3和跨膜区4之间。cldn18.2限制性表达于分化成熟的胃黏膜上皮细胞以及多种肿瘤细胞表面，在胃干细胞区及其他正常组织中不表达。
3.cldn18.2的异常表达与多种癌症的发生发展密切相关。有研究表明，cldn18.2的表达升高与胆管肿瘤的形成有关，cldn18.2参与了人体内胆管腺癌细胞的发生、增殖和侵袭过程，在胆管腺癌侵袭前沿细胞表面过表达。此外，在非小细胞肺癌的恶性转化中也有cldn18.2的异常活化。然而，在oshima等的研究中，胃癌侵袭的前沿组织中cldn1&2的表达量降低，揭示了胃癌细胞的增殖和侵袭可能与cldn18.2的表达下调相关。在病理状态下，claudin18.2在多种肿瘤中有的表达显著上调，包括80％的胃肠道腺瘤、60％的胰腺肿瘤。此外，cldn18.2活化还可见于食管癌、卵巢癌和肺腺癌中，因此是具有潜力治疗癌症的热门靶点。
4.imab362是德国ganymed公司开发的耙向cldn18.2的人鼠嵌合单抗，利用重组抗体表达技术在中国仓鼠卵巢细胞中生产。imab362可特异性识别细胞表面的cldm8.2而不结合cldn18.1，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)和补体依赖的细胞毒作用(complement-dependentcytotoxicity，cdc)，且具有抑制细胞增殖和介导细胞凋亡等生物学功能。在胰腺癌模型中的研究发现，mab362能够特异性结合胰腺癌细胞并介导adcc和cdc使细胞裂解凋亡，裂解能力与细胞表面cldn18.2表达量呈正相关。而且，化疗药物吉西他滨可上调体外培养的人胰腺癌细胞中cldn18.2的表达，增强imab362诱导的adcc活性。在来自人胰腺癌细胞系(包括吉西他滨耐药系)的小鼠异种移植瘤中，imab362能减缓肿瘤生长，延长小鼠生存时间，并降低转移瘤的发展潜能。
5.树突状细胞(dc)在启动免疫反应中发挥关键作用,是机体内最重要、功能最强的专职抗原递呈细胞,因此是抗肿瘤免疫的最好佐剂。近年来许多研究证实,将不同形式肿瘤抗原负载的dc制成疫苗,可以在体内外诱导特异杀伤性t细胞(ctl)的生成,激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能,并在恶性肿瘤尝试性治疗中取得了令人振奋的疗效。目前,dc介导的瘤苗主要有以下几种
①
抗原肽刺激的dc；
②
肿瘤提取物刺激的dc；
③
肿瘤抗原基因转染的dc；
④
肿瘤细胞与dc的融合细胞；
⑤
抗原肽刺激dc的亚细胞结构疫苗。肿瘤抗原的各种负载形式均可以有效负载dc。
6.肿瘤模型的研究也证明肿瘤抗原基因转导的dc疫苗对已形成的肿瘤有治疗作用。
研究了肿瘤抗原基因修饰的dc作为疫苗对表达靶肿瘤抗原的b16/f10黑色瘤的治疗作用,结果发现接种mage21基因转导的dc可导致肺转移模型中转移瘤数量减少,动物生存期延长，皮下肿瘤模型中部分可长期治愈。此外，从肿瘤细胞系中分离的肿瘤mrna可被体外扩增而不会丧失其生物学功能。从黑色瘤b16/f1019细胞系中扩增的mrna转导鼠dc能够在鼠体内刺激产生ctl反应,对术后肿瘤的转移产生保护性免疫反应。
7.但是目前，针对肿瘤dc疫苗的研究还不够多，特别别是将肿瘤dc疫苗与特异性的治疗抗体一起使用的研究也不够多，有待于进一步的开发。


技术实现要素：

8.本发明一方面，本发明提供一种特异性的dc瘤苗。
9.所述dc瘤苗是将dc成熟细胞与胃癌snu601细胞株mrna混合均匀，选择电压700v，脉冲时程为230μs，反应温度为4℃条件下电击细胞，电转染后30min加入含有10％胎牛血清的alys-505培养液，置37℃、5.0％co2培养箱中培养48h即可。
10.本发明另外一方面，提供了特异性的dc瘤苗在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。
11.进一步的，所述药物组合物还可以包含其他常用的治疗药物，如抗体，小分子化合物。
12.进一步的，通常，治疗有效量的本文所述抗体，小分子或其它化合物或组合物可以在0.01mg/kg至100mg/kg的范围内，以及它们之间的所有值。例如，它可以是0.1mg/kg-100mg/kg，0.1mg/kg-50mg/kg，1mg/kg-50mg/kg等。
13.进一步的，通常，治疗有效量的本文所述dc瘤苗，可以在1*10
6-1*10
11
/kg的范围内，以及它们之间的所有值。
14.另外一方面，本发明还提供了特异性针对cldn18.2的单克隆抗体，cldn18.2-5，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示：
15.dlvmtqtapsvpvtpgesvsiscrstawcsakltgpllywflqrpgqspqlliypwanlasgvpd rfsgsgsgtaftlrisrveaedvgvyyccqyehmtlnfgsgtkleik
16.重链可变区的氨基酸序列如seq id no.5所示：
17.vkpggslklscaasksdfdimhmswvrqtpdkrlewvairswcqlwayypdsvkgrftisrdqdk qtlylqmsslksedtamyyciwmgkycspqmwgqgttvtvs。
18.进一步的，本发明还提供了特异性针对cldn18.2的单克隆抗体在制备胃癌的药物组合物中的用途。
19.在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的cldn18.2抗体和药学上可接受的载体。
20.药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗cldn18.2抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。
21.合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，edta，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而，抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。
22.为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如水性载体，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性载体如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(tween-80)，螯合剂如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂，ph缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
23.另一方面，提供了治疗的方法，预防或缓解疾病，将受益于cldn18(特别是cldn18.2)活性调节的受试者中的病症或病症，包括给予受试者治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段，和/或本文提供的药物组合物，和/或本文提供的嵌合抗原受体。在某些实施方案中，所述疾病，病症或病症是如上所述的与cldn18(特别是cldn18.2)相关的疾病，病症或病症。
24.本文提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量取决于本领域已知的各种因素，例如体重，年龄，过去的病史，目前的药物，受试者的健康状况和交叉反应的可能性，变态反应，敏感性和不良副作用，以及疾病发展的给药途径和程度。剂量可由本领域技术人员(例如医师或兽医)按比例减少或增加，如这些和其它情况或要求所示。
25.在某些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg的治疗有效剂量给药。在某些实施方案中，给药剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始给药剂量可以高于随后的给药剂量。在某些实施方案中，给药剂量可以在整个治疗过程中根据受试者的反应而变化。
26.可以调节给药方案以提供最佳期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一剂量，或者可以随时间施用几个分开的剂量。
27.本文提供的抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的任何途径给药，例如胃肠外途径(例如皮下，腹膜内，静脉内，包括静脉输注，肌肉内或真皮内注射)或非胃肠外途
径(例如口服，鼻，眼内，舌下，直肠或局部)。
28.在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段可单独施用或与治疗有效量的第二治疗剂联合施用。例如，本文公开的抗体或其抗原结合片段可与第二治疗剂联合给药，例如，化疗剂，抗癌药物，放射治疗剂，免疫治疗剂，抗血管生成剂，靶向治疗剂，细胞治疗剂，基因治疗剂，激素治疗剂，抗病毒剂，抗生素，镇痛剂，抗氧化剂，金属螯合剂或细胞因子。
29.进一步的，本发明还提供了特异性针对cldn18.2的单克隆抗体以及dc瘤苗在制备胃癌的药物组合物中的用途。
30.所述的dc细胞是从外周血中分离制备并经过诱导成熟的dc细胞，所述dc细胞导入了胃癌snu601细胞的mrna。
31.有益效果
32.本发明特异性的制备针对胃癌的dc瘤苗，该瘤苗具有较好的刺激免疫反应，与cldn18.2单克隆抗体联合应用或者单独使用均可以有效的行使杀伤肿瘤细胞的功能，具有较好的应用价值。
附图说明
33.图1流式细胞仪检测dc细胞转化前后表面分子的表达情况结果图
34.图2dc疫苗激活t细胞增殖效果图
35.图3dc疫苗和/或cldn18.2单抗对肿瘤细胞杀伤效果图
具体实施方式
36.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.实施例1胃癌特异性dc疫苗的制备
38.将胃癌snu601细胞株采用rpmi1640培养基(含10％胎牛血清)培养，当细胞长满90％培养皿时用胰酶进行消化，按1∶3传代，取第3代处于对数生长期的细胞用于mrna提取。
39.snu601胃癌细胞株mrna的提取：将所述对数生长期的细胞，pbs洗涤，通过标准的trizol-氯仿一步法提取总rna。用无rnase的dnasei处理消除总rna池中污染的少量dna。依据dnasei试剂的说明书进行rna的纯化。使用微量分光光度计对总rna进行定量，结果显示od260/od280值为1.86，od260/od230值为1.95，说明提取的rna较为纯净，无多糖、蛋白质和小分子物质等杂质，测定总rna的浓度为1054μg/ml，浓度较高，置于-80℃保存备用。
40.dc细胞的分离、培养及负载:
41.将外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(pbmc)。用含10％自体血浆的alys-505培养液重悬pbmc细胞，分装入六孔板中，5
×
106个/ml，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％co2的培养箱中培养2h。洗涤并收集贴壁细胞于六孔板中，贴壁细胞为dc细胞，向六孔板加入含100ng/mlgm-csf、20ng/ml的il-4及10％自体血浆的alys-505培养液，置于饱和湿度、37℃、5.0％co2培养箱中诱导培养dc细胞。培养3天后半量换液
并补充新鲜的细胞因子，培养第5天加入成熟诱导因子tnf-a(20ng/ml),第7天收获成熟dc。
42.将0.5ml的dc成熟细胞浓度为5
×
106个/ml与200μg胃癌snu601细胞株mrna混合均匀，选择电压700v，脉冲时程为230μs，反应温度为4℃条件下电击细胞，电转染后30min加入含有10％胎牛血清的alys-505培养液，置37℃、5.0％co2培养箱中培养48h即可。流式细胞仪检测dcs表面分子的表达情况，结果如图1所示。
43.图1显示，电转染后，将dc瘤苗和dc进行荧光标记流式细胞仪检测表型，dc疫苗与成熟dc相比，其cdla表达显著下调(p《0.05),hla-dr无显著变化(p》0.05),cd86、cd40表达显著上调(p《0.05)，这也证明了dc瘤苗构建成功。
44.实施例2胃癌特异性dc疫苗的免疫效应验证
45.取sd大鼠骨髓来源的t淋巴细胞，与实施例1制备的dc瘤苗共孵育，以dc为对照，所述细胞密度的比例为1：10、1:20、1：50、1：100(dc：t细胞)分别加入96孔板中，共同培养96小时后，每孔加入cck8 loul,孵育2小时后，酶标仪检测每孔的光密度0d490值，结果如图2所示。
46.从图2的结果可以看出，以极少量的dc疫苗即可激活t细胞，且随比例增加，刺激t细胞增殖能力也相应增强(p《o.05)；相同比例下，dc疫苗较成熟dc有更强的剌激t细胞增殖的能力(p《0.05)。
47.实施例3人cldn18.2单克隆抗体的制备
48.以人和鼠的cldn18.1和cldn18.2的氨基酸序列为基础，通过寻找优势b细胞表位并针对计算机分析建模的结果以及特异性区分三者的优势表位序列确定了seq id no:1-3所示的人cldn18.1、人cldn18.2以及鼠cldn18.2的表位肽，将所述表位肽委托深圳市翰宇生物工程有限公司合成，只有人cldn18.2多肽与klh偶联，三个多肽分别与bsa偶联，其中人cldn18.2多肽-klh偶联复合物用于免疫小鼠，多肽与bsa偶联用于elisa检测免疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水的抗体效价。通过sds-page鉴定多肽与klh或bsa偶联成功。
49.杂交瘤细胞株的建立：4只8周龄雌性健康balb/c小鼠，首次免疫将人cldn18.2多肽-klh与等体积完全佐剂混合，腹腔注射，150μl/只。此后，间隔14d，换用不完全佐剂等量注射，共3次。融合前3d，用不加佐剂的免疫原100μl直接腹腔加强免疫。无菌取小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按10：1比例混匀，在peg4000的作用下融合，hat培养基重悬后加入96孔板，置c2o培养箱中37摄氏度培养，14d后换ht培养基，20d后可换100ml/l完全rpmi1640培养基。细胞筛选及阳性细胞克隆化：用间接elisa法筛选，200μg/l检测原人cldn18.2多肽-klh包被，5og/l的脱脂奶粉溶液封闭，取杂交瘤细胞培养上清检测，初筛阳性孔有53个。采用人cldn18.1多肽和鼠cldn18.2多肽进行反筛，去掉非特异性结合的阳性细胞，有限稀释法连续亚克隆4次，最终筛选得到阳性并且稳定表达的2株杂交瘤细胞分别是cldn18.2-5和cldn18.2-19，将阳性孔细胞扩大培养，建株并冻存。
50.腹水的制备及纯化采用体内诱生法，选取能稳定分泌抗人cldn18.2多肽的mab的杂交瘤细胞株cldn18.2-5和cldn18.2-19，1
×
108/只接种注射降植烷的balb/c小鼠腹腔，12d收集腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水抗体。纯化后腹水采用间接elisa法检测效价。结果如表1所示。
51.表1间接elisa法检测2株mab效价
[0052] 1:1081:1041:1051:1061:1071:108阴性对照
cldn18.2-5+++++
‑‑
cldn18.2-19+++++
‑‑
[0053]
从表1的结果可以看出，cldn18.2-5和cldn18.2-19的效价都达到了1:107。
[0054]
用lowry-kalokar公式计算cldn18.2-5和cldn18.2-19蛋白质的浓度分别是7.82mg/ml和7.59mg/ml，-70摄氏度保存备用。
[0055]
ig亚类检测：按小鼠mabig亚类鉴定试剂盒说明，取杂交瘤细胞培养液上清进行检测，鉴定mab所属亚类分别如表2所示。
[0056]
表2间接elisa法检测2株mab效价
[0057][0058][0059]
从表2的结果可以看出，2株单抗均是igg1亚型。
[0060]
westernblot特异性鉴定：将人工抗原人cldn18.2多肽-bsa、人cldn18.1多肽-bsa、鼠cldn18.2多肽-bsa、bsa对照进行sds-page电泳，再转至硝酸纤维素膜，用80g/l脱脂奶粉4摄氏度封闭过夜，加入纯化后mab为一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠(1：10000)，室温孵育2h，tbst洗涤3次，dab显色。结果显示cldn18.2-5和cldn18.2-19单抗只与人cldn18.2多肽-bsa结合，而不与其他抗原或者对照结合，表明本发明的单抗具有较好的特异性。
[0061]
实施例4人cldn18.2单克隆抗体cldn18.2-5的特性分析
[0062]
使用表面等离子体共振生物传感器来测量抗体cldn18.2-5与人cldn18.2抗原的亲合力。亲和力分析通过spr(biacore t200)仪器上进行分析，通过氨基偶联的方式在cm5芯片偶联抗人igg fc的抗体，将待测抗体在以30μl/min的流速流入，用偶联于芯片上的抗人igg fc的抗体捕获待测抗体；分析物(人cldn18.2)梯度稀释后(100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.13nm和0nm)，以流速30μl/min的流速流入，待测抗体与分析物结合时间120s，解离时间1200s；整个实验用hbs-ep作为运行缓冲液，芯片用10mm甘氨酸hcl、ph2.1溶液60秒脉冲进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定平衡解离常数kd。结果显示，单克隆抗体cldn18.2-5的亲和力为5.8
×
10-10
nm。
[0063]
此外，采用抗体轻重链序列鉴定试剂盒进行抗体轻重链可变区的序列扩增、测序，经过序列鉴定，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示：
[0064]
dlvmtqtapsvpvtpgesvsiscrstawcsakltgpllywflqrpgqspqlliypwanlasgvpdrfsgsgsgtaftlrisrveaedvgvyyccqyehmtlnfgsgtkleik
[0065]
重链可变区的氨基酸序列如seq id no.5所示：
[0066]
vkpggslklscaasksdfdimhmswvrqtpdkrlewvairswcqlwayypdsvkgrftisrdqdkqtlylqmsslksedtamyyciwmgkycspqmwgqgttvtvs。
[0067]
实施例5dc瘤苗联合cldn18.2-5单抗在治疗胃癌中的实验
[0068]
dc肿瘤疫苗协同cldn18.2-5对肿瘤细胞的杀伤作用实验为：(1)培养snu601胃癌细胞,取对数生长期的snu601胃癌细胞,调细胞浓度为2*105，96孔培养板looul/孔；(2)24小时后按分组分别加入：cldn18.2-5单抗(50ug/ml)，dc疫苗+t细胞(1:1共2*106/孔)、cldn18.2-5单抗(50ug/ml)+dc疫苗+t细胞(1:1共2*106/孔)，并设不加药阴性对照组，阳性对照组为nibolumab(50ug/ml)，每组分别设3个复孔；(3)继续培养96小时后，各组吸取上清，孔加入looul pbs后，cck8 loul,2小时后酶标仪检测吸光值；(4)并依据公式杀瘤率＝[(对照组0d值-实验组0d值)/对照组0d值]，分别计算各组对肿瘤细胞的杀伤率。结果如图3所示。
[0069]
实验结果显示：单纯cldn18.2-5单抗以及单纯采用dc疫苗均能够对胃癌细胞具有有效的杀伤，并且相对于空白对照组作用显著(p《0.05)。特别是cldn18.2-5单抗(50ug/ml)+dc疫苗+t细胞(1:1共2*106/孔)组具有协同的增加杀伤作用的效果，其杀伤率达到了(98.6
±
1.9)％，显著高于单独治疗组的效果。
[0070]
虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。