一种芽孢杆菌组合物和微生物菌剂及应用

1.本技术涉及农药技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌组合物和微生物菌剂及应用。


背景技术：

2.马铃薯是全球第四大重要的粮食作物，仅次于小麦、水稻和玉米。目前，我国是马铃薯第一生产大国，种植面积占世界马铃薯总面积25％，但我国马铃薯的单产产量由于病虫害的影响远低于世界发达国家。特别是近年来，随着马铃薯种植面积的扩大和连作年限延长，使得马铃薯黄萎病、疮痂病等土传病害呈现出逐年加重的趋势，对马铃薯的产量和品质构成严重威胁。
3.马铃薯黄萎病又称“早死病”，是由轮枝菌属(verticillium sp.)真菌引起的一种土传兼种传的维管束土传病害，其中以大丽轮枝菌(verticillium dahliae)与非苜蓿轮枝菌(v.nonalfalfae)为主要病原菌。目前，马铃薯黄萎病在我国内蒙古、河北、甘肃、黑龙江、山西、宁夏等地均有发生，轻者造成10％～15％的产量损失，严重时可达30％～50％，成为制约马铃薯生产的重要因素之一。
4.马铃薯疮痂病是由链霉菌属(streptomyces sp.)引起的病害，该病主要危害马铃薯块茎，影响其外观和品质，降低商品价值，在马铃薯主栽区普遍发生，有些地区的微型马铃薯发病率达30％～60％，给马铃薯生产造成了极大的经济损失。
5.目前，常见以化学药剂防治以上两种马铃薯土传病害，然而化学杀菌剂长期使用不仅易使病原菌产生耐药性，而且造成了严重的农业生态环境污染等问题，对人类健康产生威胁。
6.微生物杀菌剂由于其特异性防效、无毒副残留及环境友好等特点而成为作物病害绿色防控的重要措施，得到人们的广泛关注。目前，应用于防治马铃薯黄萎病与疮痂病的微生物杀菌剂产品较少，因此，开展防治马铃薯土传病害的高效绿色微生物杀菌剂产品及技术研究十分必要，以应对现在的市场需求。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种芽孢杆菌组合物和微生物菌剂及应用。该芽孢杆菌组合物可有效抑制马铃薯黄萎病菌、马铃薯疮痂病菌等病原菌，具有显著的协同增效作用，可有效防治马铃薯黄萎病和马铃薯疮痂病。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了一种芽孢杆菌组合物，该芽孢杆菌组合物由枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)hmb26553和解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)phodg36组成。
10.本发明中，枯草芽孢杆菌hmb26553保藏编号为cgmcc no.13211，该菌株已在申请号为201710157385.6的专利文件中进行了公开；解淀粉芽孢杆菌phodg36保藏编号为cgmcc no.13041，该菌株已在申请号为201610876803.2的专利文件中进行了公开。
11.作为优选，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36的活菌数比例为(1
～100)：(1～100)。
12.优选地，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36的活菌数比例为(1～10)：(1～10)。
13.更优选地，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36的活菌数比例为(1～5)：(1～5)。
14.在本发明提供的具体实施例中，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36的活菌数比例为1：1。
15.本发明还提供了一种芽孢杆菌组合物母药，包括上述芽孢杆菌组合物和载体。
16.作为优选，芽孢杆菌组合物母药中，枯草芽孢杆菌hmb26553或解淀粉芽孢杆菌phodg36的活菌数为(1～100)
×
10
10
cfu/g。
17.优选地，芽孢杆菌组合物母药中，枯草芽孢杆菌hmb26553或解淀粉芽孢杆菌phodg36的活菌数为(1～10)
×
10
10
cfu/g。
18.在本发明提供的具体实施例中，芽孢杆菌组合物母药中，枯草芽孢杆菌hmb26553或解淀粉芽孢杆菌phodg36的活菌数为(1～5)
×
10
10
cfu/g。
19.作为优选，载体选自高岭土、滑石粉、陶土、石灰粉、石膏、皂土、硅藻土、白炭黑、磷酸盐、砂石、浮石、泥煤、硅酸钙中的一种或几种。本领域认可的其它载体种类也在本发明的保护范围之内。
20.本发明还提供了上述芽孢杆菌组合物母药的制备方法，包括：
21.将枯草芽孢杆菌hmb26553的菌株发酵液和/或解淀粉芽孢杆菌phodg36的菌株发酵液进行离心浓缩，将载体与所得浓缩液混合，喷雾干燥。两种菌株发酵液可以一起离心浓缩，也可以分别离心浓缩；两种菌株浓缩液可以一起喷雾干燥，也可以分别喷雾干燥。
22.本发明还提供了一种微生物菌剂，包括上述芽孢杆菌组合物和/或芽孢杆菌组合物母药，以及农药学上可接受的辅料。
23.作为优选，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、乳油、微乳、水乳、悬浮剂、水分散粒剂中的一种。
24.在本发明提供的实施例中，农药学上可接受的辅料包括但不限于润湿剂、分散剂、紫外保护剂、填料、渗透剂、防冻剂、增稠剂、增效剂、溶剂、乳化剂、消泡剂、ph调节剂中的一种或几种。
25.在本发明提供的具体实施例中，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂，农药学上可接受的辅料包括但不限于润湿剂、分散剂、紫外保护剂、填料中的一种或几种。
26.在本发明中，润湿剂为本领域常规的润湿剂，润湿剂可选自十二烷基苯磺酸钠(sdbs)、丁基萘磺酸钠(拉开粉bx)、berol 790a(烷基磺酸钠盐)、sp-2846bw、gy-w04、lt-569、十二烷基硫酸钠、木质素磺酸盐、异丙基萘磺酸钠、烷基芳基磺酸钠等中的一种或多种。在本发明提供的具体实施例中，润湿剂为lt-569。
27.在本发明中，分散剂为本领域常规的分散剂，分散剂可选自亚甲基双萘磺酸钠(nno)、聚萘甲醛磺酸钠盐(mf)、morwet d-425(烷基萘磺酸盐甲醛缩合物)、磷酸酯、磺酸盐类、烷基萘磺酸盐缩聚物、羧酸盐高分子、聚羧酸盐高分子改性树脂、烷基硫酸盐、改性烷基磺酸盐、烷基萘磺酸缩聚物钠盐、萘磺酸盐缩聚物类、聚羧酸盐高分子分散剂、多苯乙烯苯醚磷酸酯分散剂、萘磺酸盐甲醛缩合物、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物磺酸盐、木质素磺酸
盐、马来酸-丙烯酸共聚物钠盐、烷基磺基琥珀酸盐等中的一种或多种。在本发明提供的具体实施例中，分散剂为mf。
28.在本发明中，紫外保护剂为本领域常规的紫外保护剂，紫外保护剂可选自抗坏血酸、荧光素钠、糊精、叶酸、脱脂奶粉中的一种或多种。在本发明提供的具体实施例中，紫外保护剂为抗坏血酸。
29.在本发明中，填料为本领域常规的填料，填料可选自高岭土、滑石粉、陶土、石灰粉、石膏、皂土、硅藻土、白炭黑、磷酸盐、砂石、浮石、泥煤、硅酸钙中的一种或多种。在本发明提供的具体实施例中，填料为滑石粉。
30.作为优选，以重量份计，可湿性粉剂中各组分的用量为：
[0031][0032]
本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，包括：将芽孢杆菌组合物和/或母药与润湿剂、分散剂、紫外保护剂、滑石粉进行混合、搅拌，经气流粉碎后过300～500目筛。
[0033]
本发明还提供了上述芽孢杆菌组合物、芽孢杆菌组合物母药或微生物菌剂在抑制植物病原真菌和/或防治马铃薯土传病害中的应用；
[0034]
优选地，植物病原真菌包括轮枝菌属真菌和/或链霉菌属细菌；
[0035]
优选地，轮枝菌属真菌为大丽轮枝菌(verticillium dahliae)
[0036]
优选地，链霉菌属细菌为streptomyces scabies。
[0037]
优选地，马铃薯土传病害包括马铃薯黄萎病和/或马铃薯疮痂病。
[0038]
本发明提供了一种芽孢杆菌组合物和微生物菌剂及应用。该芽孢杆菌组合物由枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)hmb26553和解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)phodg36组成。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
[0039]
本发明将枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36联合使用后，在对马铃薯黄萎病菌、马铃薯疮痂病菌等病原菌的抑制作用方面产生了显著的协同增效作用；
[0040]
本发明的芽孢杆菌可湿性粉剂，以枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36作为活性成分，施用后能够迅速定殖到植物根围，通过与病原菌竞争侵染位点、分泌抑菌活性物质和促进植物营养吸收等作用，达到防治马铃薯黄萎病与疮痂病的效果，同时能提高马铃薯的产量；
[0041]
本发明的芽孢杆菌可湿性粉剂，安全高效、无毒无残留，对人体和环境友好，能够减少化学农药的使用；同时使用方式灵活，可根据不同情况选择拌种或滴灌，节约人力及使用成本。同时该可湿性粉剂制备方法简单、成本低、适宜工业化生产。
具体实施方式
[0042]
本发明公开了一种芽孢杆菌组合物和微生物菌剂及应用，本领域技术人员可以借
鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0043]
本发明提供了一种芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用，以实现安全且高效的防治马铃薯黄萎病与疮痂病。
[0044]
所述芽孢杆菌可湿性粉剂有效成分为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)hmb26553与解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)phodg36，此外还含有润湿剂、分散剂、紫外保护剂和填料，将所述各原料组份进行适当重量配比，最终制备得到芽孢杆菌可湿性粉剂。制备的芽孢杆菌可湿性粉剂芽孢含量为不低于30亿cfu/g，杂菌率不高于3％，ph不高于7.8，细度不低于98％，干燥减量不高于1.6％，悬浮率不低于80％，润湿时间不高于96s，制备方法稳定。
[0045]
本发明所采用的技术方案为：
[0046]
一种芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量分组成：枯草芽孢杆菌hmb26553母药10-15份，解淀粉芽孢杆菌phodg36母药10-15份，润湿剂lt-569 1-3份，分散剂：mf 1-3份，紫外保护剂抗坏血酸1-3份，滑石粉61-77份。
[0047]
一种芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成：
[0048]
一、枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36发酵液的制备
[0049]
将冻存的hmb26553菌株与phodg36菌株转至lb固体培养基上，37℃培养24h，得到活化菌株；分别挑取两菌株单菌落接种至克氏瓶中(内装250ml lb固体培养基)，37℃培养3d-5d，用400-500ml无菌水洗下克氏瓶中的菌苔，接种于装有200l种子培养基的1000l种子发酵罐中，初始ph值为7.8-8.0，温度为32℃，通气量与转速根据溶氧值实时调节，以保证溶氧最高；接种后10-12h时，菌体生长处于指数生长中期，转入装有3000l发酵培养基的5000l发酵罐中，ph值为7.8-8.0，温度为32℃，通气量与转速根据溶氧值实时调节，以保证溶氧最高，培养18-24小时，菌体浓度≥40亿/ml，芽孢形成率≥95％，即可结束发酵，得到所述枯草芽孢杆菌hmb26553发酵液与解淀粉芽孢杆菌phodg36发酵液；
[0050]
其中，所述lb固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1000ml，ph 7.0-7.5，121℃灭菌30min；
[0051]
其中，所述种子培养基：玉米粉30g、豆饼粉20g、磷酸二氢钠4g、磷酸二氢钾0.3g、碳酸钠1g、硫酸镁0.5g、碳酸钙2g，水1000ml，ph 7.0-7.5；121℃灭菌30min；
[0052]
其中，所述发酵培养基：玉米粉30g、豆饼粉20g、磷酸二氢钠4g、磷酸二氢钾0.3g、碳酸钠1g、硫酸镁0.5g、碳酸钙2g，水1000ml，ph 7.0-7.5；121℃灭菌30min；
[0053]
二、枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36母药的制备
[0054]
将hmb26553菌株发酵液与phodg36菌株发酵液采用碟片式离心机进行离心浓缩，将高岭土按20％-30％的添加量加至浓缩液中，利用喷雾干燥塔进行喷雾干燥，进口温度为170℃-175℃，出口温度为50℃-55℃，得到hmb26553菌株与phodg36菌株母药。
[0055]
三、一种芽孢杆菌可湿性粉剂的制备
[0056]
将hmb26553菌株母药10-15份、phodg36菌株母药10-15份、润湿剂lt-569 1-3份，分散剂mf 1-3份，紫外保护剂抗坏血酸1-3份与滑石粉61-77份进行混合、搅拌、气流粉碎后
过300目-400目筛，检测其芽孢含量不低于30亿cfu/g，杂菌率不高于3％，ph不高于7.8，细度不低于98％，干燥减量不高于1.6％，悬浮率不低于80％，润湿时间不高于96s，得到所述芽孢杆菌可湿性粉剂。
[0057]
其中，所述芽孢杆菌可湿性粉剂最佳的重量份组成为：hmb26553菌株母药10份、phodg36菌株母药10份、润湿剂lt-569 1份，分散剂mf 2份，紫外保护剂抗坏血酸1份，填料滑石粉76份。
[0058]
本发明中所用试剂、材料等均可由市场购得。
[0059]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0060]
实施例1杀菌组合物的制备
[0061]
一、枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36发酵液的制备
[0062]
将冻存的hmb26553菌株与phodg36菌株转至lb固体培养基上，37℃培养24h，得到活化菌株；分别挑取两菌株单菌落接种至克氏瓶中(内装250ml lb固体培养基)，37℃培养3d-5d，用500ml无菌水洗下克氏瓶中的菌苔，接种于装有200l种子培养基的1000l种子发酵罐中，初始ph值为7.8-8.0，温度为32℃，通气量与转速根据溶氧值实时调节，以保证溶氧最高；接种后10-12h时，菌体生长处于指数生长中期，转入装有3000l发酵培养基的5000l发酵罐中，ph值为7.8-8.0，温度为32℃，通气量与转速根据溶氧值实时调节，以保证溶氧最高，培养18-20小时，菌体浓度≥50亿/ml，芽孢形成率≥95％，得到所述枯草芽孢杆菌hmb26553发酵液与解淀粉芽孢杆菌phodg36发酵液；
[0063]
其中，所述lb固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1000ml，ph 7.0-7.5，121℃灭菌30min；
[0064]
其中，所述种子培养基：玉米粉30g、豆饼粉20g、磷酸二氢钠4g、磷酸二氢钾0.3g、碳酸钠1g、硫酸镁0.5g、碳酸钙2g，水1000ml，ph 7.0-7.5；121℃灭菌30min；
[0065]
其中，所述发酵培养基：玉米粉30g、豆饼粉20g、磷酸二氢钠4g、磷酸二氢钾0.3g、碳酸钠1g、硫酸镁0.5g、碳酸钙2g，水1000ml，ph 7.0-7.5；121℃灭菌30min。
[0066]
二、杀菌组合物的制备
[0067]
将上述制备的hmb26553菌株发酵液与phodg36菌株发酵液按照1:1比例混合均匀，备用。混合液中，菌体浓度≥50亿/ml，hmb26553菌株与phodg36菌株的菌体数量比例大约为1：1。
[0068]
试验例1杀菌组合物对病菌的抑制作用试验
[0069]
(一)杀菌组合物对马铃薯黄萎病菌的抑制作用试验
[0070]
1.供试马铃薯黄萎病菌(verticillium dahaliae)vd-p6为河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室分离并保存。
[0071]
2.试验方法：
[0072]
供试菌株发酵液的制备：
[0073]
①
hmb26553菌株发酵液：取实施例1制备的发酵液备用；
[0074]
②
phodg36菌株发酵液：取实施例1制备的发酵液备用；
[0075]
③
hmb26553与phodg36混合液：取实施例1制备的hmb26553菌株发酵液与phodg36菌株发酵液，按照1:1比例混合均匀，备用。
[0076]
采用平板对峙法测定上述待测液对马铃薯黄萎病菌的抑制作用。首先将马铃薯黄
萎病菌在pda平板上活化培养10-14天，然后用无菌打孔器(直径6mm)在菌落边缘打取菌盘，转接至另一pda平板中央，接着用移液枪分别吸取上述几种待测液接种在距菌盘2.0厘米处，每滴20μl。以不接种待测液只接种病原菌的平板为空白对照，每处理3次重复。25℃培养，待空白对照病原菌长至培养皿边缘时，测量对照病原菌直径和处理病原菌直径，计算抑菌率。
[0077]
抑菌率(％)＝(对照病原菌直径-处理病原菌直径)/对照病原菌直径
×
100。
[0078]
结果表明，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36两株细菌对马铃薯黄萎病菌均具有较强的抑制作用，hmb26553菌株对马铃薯黄萎病菌的抑制率达72.7％，phodg36菌株对马铃薯黄萎病菌的抑制率为70.9％，二者混合液对马铃薯黄萎病菌的抑制率高于单一菌株，达到78.4％(表1)。结果表明，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36联合使用后，在抑菌方面产生了显著的协同增效作用。
[0079]
表1芽孢杆菌hmb26553与phodg36对马铃薯黄萎病菌的抑制作用结果
[0080][0081]
(二)杀菌组合物对马铃薯疮痂病菌的抑制作用试验
[0082]
1.供试马铃薯疮痂病菌(streptomyces scabies)为河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室分离并保存。
[0083]
2.试验方法：
[0084]
供试菌株发酵液的制备：同上。
[0085]
将马铃薯疮痂病病原菌接种于燕麦琼脂培养基上，28℃培养7-10d，用无菌水洗下孢子并调整浓度至106cfu/ml，取100μl孢子悬液涂布于高氏ⅰ号培养基平板上，用移液枪分别吸取20μl上述几种待测液接种在平板中央，28℃培养7d后测量抑菌圈直径，以抑菌圈大小来判断抑菌效果。每处理重复5次。
[0086]
结果表明，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36两株细菌对马铃薯疮痂病菌均具有较强的抑制作用，hmb26553菌株对马铃薯疮痂病菌的抑菌圈直径为10.8mm，phodg36菌株对马铃薯疮痂病菌的抑菌圈直径为11.5mm，二者混合液对马铃薯疮痂病菌的抑菌圈直径高于单一菌株，达到13.3mm(表2)。结果表明，枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36联合使用后，在抑菌方面产生了显著的协同增效作用。
[0087]
表2芽孢杆菌hmb26553与phodg36对马铃薯疮痂病病菌的抑制作用结果
[0088]
处理抑菌圈直径(mm)hmb2655310.8
±
0.2phodg3611.5
±
0.3hmb26553+phodg36(1：1)13.3
±
0.2
[0089]
实施例2芽孢杆菌可湿性粉剂的制备
[0090]
本实施例的芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成：
[0091]
枯草芽孢杆菌hmb26553母药10份，解淀粉芽孢杆菌phodg36母药10份，润湿剂lt-569 1份，分散剂mf 2份，紫外保护剂抗坏血酸1份，填料滑石粉76份。
[0092]
该芽孢杆菌可湿性粉剂制备方法包括以下步骤：
[0093]
一、枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36发酵液的制备
[0094]
制备方法同实施例1。
[0095]
二、枯草芽孢杆菌hmb26553与解淀粉芽孢杆菌phodg36母药的制备
[0096]
将hmb26553菌株发酵液与phodg36菌株发酵液采用碟片式离心机进行离心浓缩，将高岭土按30％的添加量加至浓缩液中，利用喷雾干燥塔进行喷雾干燥，进口温度为172℃，出口温度为55℃，得到hmb26553菌株与phodg36菌株母药。检测其芽孢含量分别为3.24
×
10
10
cfu/g与3.36
×
10
10
cfu/g，并加入高岭土将其芽孢含量分别调整至200亿cfu/g。
[0097]
三、芽孢杆菌可湿性粉剂的制备
[0098]
将hmb26553菌株母药10份、phodg36菌株母药10份与润湿剂lt-569 1份，分散剂mf 2份，紫外保护剂抗坏血酸1份及滑石粉76份进行混合、搅拌、气流粉碎后过400目筛，检测其芽孢总含量为37.6亿cfu/g，杂菌率2.8％、ph 7.8、细度98.2％、干燥减量1.6％、润湿时间95.7s、悬浮率80.7％，得到芽孢杆菌可湿性粉剂。
[0099]
试验例2芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯生长的影响
[0100]
采用盆栽试验评价实施例2所得芽孢杆菌可湿性粉剂不同用量对马铃薯生长的影响，试验于河北省农林科学院植物保护研究所温室开展。将健康马铃薯种薯切成35～50g左右的薯块(1～2芽眼/块)置于塑料薄膜上，在薯块表面撒上芽孢杆菌可湿性粉剂，翻动搅拌使薯块表面着药均匀后种植于装有育苗基质的花盆中(直径16cm，深13cm)，在温室中进行培养。试验设置3个浓度处理：可湿性粉剂1kg/667m2、2kg/667m2和3kg/667m2拌种，每处理重复3次，每重复种植6盆，每盆2块种薯。马铃薯品种为费乌瑞它(荷兰15)，按亩用种薯量150kg计算盆栽试验用药量。以滑石粉3kg拌种处理作为空白对照(ck)。播种30d后调查各处理出苗数量，计算出苗率；40d后调查马铃薯植株株高，观察不同剂量处理对马铃薯生长的影响。
[0101]
出苗率(％)＝(出苗数量/12)
×
100
[0102]
校正出苗率(％)＝(处理的出苗率/空白对照的出苗率)
×
100
[0103]
由表3可以看出，播种30d时，可湿性粉剂处理的校正出苗率与空白对照相比差异均不显著；播种40d时，各处理株高之间差异不显著(表3)。该结果说明应用30亿cfu/g芽孢杆菌可湿性粉剂1～3kg/667m2拌种处理对马铃薯出苗和生长是安全的。
[0104]
表3芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯出苗与株高的影响
[0105]
处理校正出苗率(％)株高(cm)ck100.0
±
0.0a32.9
±
3.0a1kg/667m2100.0
±
0.0a29.0
±
1.8a2kg/667m297.2
±
2.8a29.5
±
3.1a3kg/667m294.4
±
2.8a31.6
±
1.7a
[0106]
试验例3芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯黄萎病的防治效果
[0107]
采用伤根接种法人工接种马铃薯黄萎病菌，评价芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯黄
萎病的防治效果。试验于河北省农林科学院植物保护研究所温室开展。待试验例2中调查完马铃薯株高后，在种植马铃薯的花盆底部约2cm处用壁纸刀横切一圈，并置于装有马铃薯黄萎病菌孢子悬浮液(107个孢子/ml)的育苗盒中浸泡30min后取出继续培养。接种21d后调查马铃薯黄萎病发生情况。病级划分按照5级分级标准：
[0108]
0级，健康植株，叶片无症状；
[0109]
1级，25％以下叶片发病的植株，叶片出现淡黄色或呈不规则形的黄色病斑；
[0110]
2级，26％～50％叶片发病的植株，病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘上卷略有干枯；
[0111]
3级，51％～75％叶片发病的植株，少数叶片凋落；
[0112]
4级，76％以上叶片发病的植株，叶片脱落或植株枯死。
[0113]
并按照以下公式计算病情指数和防效。
[0114]
病情指数＝σ(病级
×
相应病级株数)/(4
×
总株数)
×
100
[0115]
防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100
[0116]
试验结果表明，芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯黄萎病具有较好的防治效果，种薯经可湿性粉剂1～3kg/667m2拌种处理后，马铃薯黄萎病的病情指数均显著低于空白对照(33.1)，防效介于45.1％～47.4％(表4)。
[0117]
表4芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯黄萎病的防治效果
[0118]
处理病情指数防治效果(％)空白对照ck33.1
±
6.7a-1kg/667m218.2
±
4.1b45.12kg/667m217.4
±
3.7b47.43kg/667m218.0
±
3.8b45.6
[0119]
试验例4田间小区试验评价芽孢杆菌可湿性粉剂在马铃薯上的应用效果
[0120]
在河北省承德市围场满族蒙古族自治县城子乡桃山村开展田间小区试验，评价芽孢杆菌可湿性粉剂1kg/667m2、2kg/667m2和3kg/667m2拌种在马铃薯上的应用效果。试验田土壤均为沙壤土，地势平整，水肥条件较好。马铃薯品种为费乌瑞它(荷兰15)。以70％甲基托布津可湿性粉剂0.1kg、3％中生菌素可湿性粉剂0.1kg与滑石粉2.8kg混匀后拌种处理作为化学药剂对照，以滑石粉3kg拌种处理作为空白对照(ck)。按亩用种薯量150kg计算田间小区试验的用药量，每个处理重复4次，共20个小区，随机排列。小区面积为20m2(1m
×
20m)。每小区连续调查30株马铃薯植株的黄萎病发生情况，计算病情指数及防效(同试验例3)。在马铃薯收获期，定点取样进行测产并调查块茎疮痂病的发病情况。测产时按照每小区选定2m2面积的马铃薯植株作为样点，将其中植株全部挖出，记录马铃薯薯块总重量，按照下列公式计算亩产量、增产率、疮痂病发病率及防效。
[0121]
亩产量(kg/667m2)＝测产样点薯块产量
×
333.5
[0122]
增产率(％)＝(处理的亩产量-空白对照的亩产量)/空白对照的亩产量
×
100
[0123]
发病率(％)＝发病马铃薯块茎数/收获总马铃薯块茎数
×
100
[0124]
防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率
×
100
[0125]
经调查，在桃山村小区试验地块未发生马铃薯黄萎病，但有马铃薯疮痂病的发生。经芽孢杆菌可湿性粉剂不同剂量拌种处理后，马铃薯疮痂病的发病率均显著低于空白对
照。1kg/667m2与3kg/667m2拌种处理后，马铃薯疮痂病发病率与化学药剂对照差异不显著，防效分别为56.8％与52.5％；2kg/667m2拌种处理后，马铃薯疮痂病发病率(7.2％)显著低于化学药剂对照(11.1％)，防效达到72.0％。在产量方面，1～3kg/667m2拌种处理后亩产量均高于空白对照区(3431.8kg/667m2)，增产率6.1％～15.5％，其中2kg/667m2拌种处理增产率最高，达到15.5％(表5)。因此选择可湿性粉剂2kg/667m2拌种作为田间示范用药量。
[0126]
表5田间小区试验中芽孢杆菌可湿性粉剂在马铃薯上的应用效果
[0127][0128]
试验例5田间应用示范评价芽孢杆菌可湿性粉剂在马铃薯上的应用效果
[0129]
在河北省承德市围场满族蒙古族自治县城子乡桃山村、十九号村、拔上村及御道口镇桦树林村开展田间应用示范，评价芽孢杆菌可湿性粉剂拌种处理在马铃薯上的防病增产效果。马铃薯品种为兴佳2号。示范设置2个处理，处理1为可湿性粉剂2kg/667m2拌种处理，处理2为化学药剂对照处理(同试验例4)。每处理示范面积150亩。在马铃薯黄萎病发生高峰期调查黄萎病发病情况，计算病情指数(同试验例3)；在马铃薯收获期，测产并调查薯块疮痂病发生情况，计算发病率、防病效果和增产率(同试验例4)。
[0130]
在桃山村与拔上村两地的示范结果表明，与化学药剂对照相比，30亿cfu/g芽孢杆菌可湿性粉剂2kg/667m2拌种能够显著降低马铃薯黄萎病的病情指数，防效分别达到62.1％与50.8％；在产量方面，桃山村的可湿性粉剂处理显著高于化学药剂对照，增产率达到28.1％；拨上村可湿性粉剂处理与化学药剂对照无显著性差异，但产量仍明显高于化学药剂对照，增产率为14.3％(表6)。在十九号村与桦树林村两地的示范结果表明，与化学药剂对照相比，可湿性粉剂2kg/667m2拌种处理能够显著降低马铃薯疮痂病的发病率，防效分别达到63.9％与65.7％。在产量方面，两地可湿性粉剂处理均显著高于化学药剂对照，增产率分别为29.4％与16.7％(表7)。
[0131]
表6大区示范中芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯黄萎病及产量的影响
[0132][0133]
表7大区示范中30亿cfu/g芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯疮痂病和产量的影响
[0134][0135]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。