RNF122在制备抗肿瘤药物中的应用

rnf122在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物药物技术领域，具体涉及rnf122在制备抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.目前，癌症已经成为了威胁人类生命健康的重要疾病之一。最新研究报道表明，乳腺癌在女性癌症中发病率仍居首位，而致死率也跃居第一位，因此，乳腺癌已成为威胁女性生命健康的重要杀手。乳腺癌具有高转移性，这也是乳腺癌致死的主要原因之一。低氧是控制癌症进展过程中极其关键的微环境调控因素，尤其是在乳腺癌的发生发展中发挥着重要作用。很多证据表明，低氧微环境，特别是低氧诱导因子(hif-1)信号通路激活，在驱动乳腺癌侵袭性、治疗抵抗和预后不良等方面起着至关重要的作用。为了抵抗由于乳腺癌细胞快速增殖引起的低氧应激，乳腺癌细胞会通过激活各种生存相关通路，促进肿瘤转移，以及肿瘤血管生成等过程来适应低氧应激。在临床上，转移是影响乳腺癌治疗的主要挑战。
3.rnf122(ring fingerprotein 122)属于ring家族的e3泛素连接酶，其主要特征结构包括n端的横跨膜结构域(tm)和c端的ring-finger结构域。目前关于rnf122的功能鲜有报道，而其在肿瘤中的功能更不明确。有文献阐明鼠源的rnf122可以通过k48多聚泛素化修饰促进rig
‑ⅰ
的降解，进而抑制rna病毒感染所引发的ⅰ型干扰素的产生。也就是说rnf122可以参与负向调控病毒天然免疫反应。然而，目前rnf122在人类肿瘤中是否发挥功能与肿瘤低氧微环境是否有关联，其作用机制等并不清楚。因此，关于rnf122在人乳腺癌中的功能及机制研究具有重要的科学意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供rnf122基因或其蛋白的新用途，即rnf122基因为靶点在制备肿瘤诊断试剂、抗肿瘤药物以及抗肿瘤转移药物中的应用。
5.本发明提供了一种检测rnf122表达量的试剂在制备诊断肿瘤发生或肿瘤预后评价的试剂中的应用。
6.优选的，所述rnf122包括rnf122基因和/或rnf122蛋白。
7.优选的，检测rnf122基因表达量的试剂包括qpcr扩增引物；
8.所述qpcr扩增引物包括核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物。
9.优选的，检测rnf122蛋白表达量的试剂包括抗rnf122蛋白抗体。
10.本发明提供一种提高rnf122基因或蛋白表达水平的试剂在制备抗肿瘤药物和/或抗肿瘤转移药物中的应用。
11.优选的，所述抗肿瘤包括肿瘤细胞的生长和/或克隆。
12.优选的，所述抗肿瘤转移包括抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力、抑制肿瘤细胞对葡萄糖的摄取和抑制血管生成。
13.优选的，所述药物具有负向调控hif-1α表达的作用。
14.优选的，所述肿瘤包括乳腺癌。
15.本发明提供了抑制hif-1α转录活性的试剂在制备抑制与增殖、转移、代谢和血管内生成相关的靶基因转录的试剂盒中的应用，所述抑制hif-1α转录活性的试剂包括rnf122基因或蛋白。
16.本发明提供了一种检测rnf122表达量的试剂在制备诊断肿瘤发生或肿瘤预后评价的试剂中的应用。本发明利用蛋白质免疫印迹分析和乳腺癌组织芯片免疫组化实验表明，与正常乳腺组织相比，rnf122在乳腺癌组织中低表达；同时tcga数据库分析也表明rnf122在乳腺癌组织中低表达，同时rnf122高表达与乳腺癌患者预后呈显著正相关。因此，rnf122作为肿瘤发生以及肿瘤预后评价中检测靶点应用，根据rnf122的显著低表达辅助判断肿瘤发生风险，根据rnf122的显著高表达辅助判断肿瘤预后评价。
17.本发明提供一种提高rnf122基因或蛋白表达水平的试剂在制备抗肿瘤药物和/或抗肿瘤转移药物中的应用。本发明以稳定高表达或敲低rnf122的人乳腺癌细胞株为实验对象，通过生长曲线评价rnf122表达量对细胞的影响，平板克隆实验在常氧和低氧条件下高表达rnf122能够明显抑制乳腺癌细胞的生长和克隆形成能力，敲低rnf122会促进细胞生长及克隆形成能力；同时transwell实验结果表明在常氧和低氧条件下高表达rnf122抑制mda-mb-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，敲低rnf122促进细胞迁移和侵袭能力。可见，rnf122基因或蛋白高表达有利于抑制肿瘤细胞的生长增殖以及转移能力。
附图说明
18.图1为rnf122在乳腺癌患者组织中的表达情况，其中a是应用免疫组织化学方法检测rnf122在人乳腺癌组织及邻近正常组织中的表达情况及统计结果(乳腺癌组织n＝41，邻近正常组织n＝41)；b是westernblot检测rnf122在乳腺癌患者癌旁与癌组织中的表达情况及定量图；c图是tcga数据库；d图是tcga数据库分析rnf122在乳腺癌样本中表达；e图是rnf122表达水平与乳腺癌患者总生存期的相关性；
19.图2为rnf122抑制mcf7细胞增殖，a为过表达rnf122平板克隆实验结果，左侧为形态图，右侧为用imagej软件统计结果；b为过表达rnf122生长曲线实验结果，c为敲降rnf122平板克隆实验结果，左侧为形态图，右侧柱状图为用imagej软件对克隆统计图；d为敲降rnf122生长曲线实验结果，柱形图代表3个独立实验的数据，误差线表示平均值(sd)的标准误差，****p分别表示p《0.0001；
20.图3为rnf122抑制mda-mb-231细胞增殖，a为平板克隆实验结果，b为生长曲线实验结果，c为mda-mb-231细胞敲降rnf122平板克隆实验验检测细胞克隆形成能力，右侧柱状图为克隆统计结果，利用imagej软件进行统计，d为生长曲线实验结果，一组常氧条件培养，一组低氧条件培养，每隔一天数细胞进行细胞增殖计数，柱形图代表3个独立实验的数据，误差线表示平均值(sd)的标准误差，****p分别表示p《0.0001；
21.图4为rnf122过表达抑制异种移植瘤生长，a为最终肿瘤大小结果，b为瘤体重统计结果，c为瘤子生长体积变化过程，每隔一天测一次，d为最终肿瘤大小，e为瘤体重统计，f为瘤子体积增长过程，柱形图代表3个独立实验的数据，误差线表示平均值(sd)的标准误差，**p，***p，****p分别表示p《0.01，p《0.001，p《0.0001，折线图用two-wayanova统计；
22.图5为rnf122抑制mda-mb-231细胞迁移和侵袭结果，a和c为细胞划痕实验验证
rnf122对mda-mb-231迁移影响；b和d为利用imagej进行伤口愈合程度统计；e和f为transwell不加基质胶实验验证rnf122对mda-mb-231迁移影响，g和h为transwell加基质胶实验验证rnf122对mda-mb-231侵袭影响，h图为imagej进行细胞计数统计结果，柱形图代表3个独立实验的数据，误差线表示平均值(sd)的标准误差，**p，***p，****p分别表示p《0.01，p《0.001，p《0.0001；
23.图6为rnf122抑制hif-1α的表达结果，a为mcf7细胞外源转染pcdna3.1-flag-rnf122及对照质粒，转染24h后将细胞分别放入低氧(1％o2)处理0、1、3、6、9、12小时，westernblot验证hif-1α表达，b为mda-mb-231细胞外源转染pcdna3.1-flag-rnf122及对照质粒，转染24h后，将细胞分别低氧处理0、3、6、12h，western blot验证hif-1α表达，c为将对照质粒及pcdna3.1-3
×
flag-rnf122质粒分别与pcdna3.1-ha-hif-1α共转到hek293t细胞，再进行ip实验用flag或ha作为诱饵蛋白，d为将对照与3
×
flag-rnf122质粒分别转染到hek293t细胞，再低氧处理6h，再进行ip处理，分别用flag和hif-1α作为诱饵蛋白；
24.图7为乳腺癌细胞中rnf122通过泛素蛋白酶体途径降解hif-1α，其中a为chx稳定性实验结果，右侧是hif-1α表达定量图，b为mcf7细胞分别转染对照和flag-rnf122质粒后用蛋白酶体抑制剂ps341处理6h后蛋白表达结果，c为3
×
flag-rnf122及3
×
flag-rnf122 c93/96a突变体分别与ha-hif-1α和his-ub共转到hek293t细胞中，转染24h后，再用200nm ps341处理6h，用ha做诱饵蛋白；用imagej进行蛋白灰度值统计；
25.图8为低氧条件下rnf122抑制hif1α转录活性，抑制乳腺癌细胞葡萄糖摄取及血管形成能力；a为双荧光素酶报告实验。将pgl3-hre reporter、renila与0、200、400和500ng flag-rnf122共转在mcf7细胞，及在rnf122敲降稳转细胞中转染pgl3-hre reporter，转染24h后，一组常氧，一组低氧(1％o2)处理6h；b为葡萄糖摄取实验，rnf122过表达或敲降mcf7稳转细胞低氧处理6h，按葡萄糖摄取检测试剂盒说明处理细胞，检测rnf122对mcf7葡萄糖摄取能力影响；c为mda-mb-231ctl rnf122稳转细胞低氧(1％o2)处理12h后收集培养基作为条件性培养基培养huvec细胞；柱状图为用imagej血管生成软件分析统计结果，柱形图代表3个独立实验的数据，误差线表示平均值(sd)的标准误差，***p，****p分别表示p《0.001，p《0.0001；
26.图9为常氧或低氧条件下，rnf122通过hif-1α抑制mda-mb-231细胞增殖，a和b为生长曲线实验验证了常氧和低氧(1％o2)处理条件下，ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231细胞增殖影响；c和d为平板克隆实验验证了常氧和低氧处理条件下ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231克隆形成能力影响，每孔铺2，000个细胞，共长15天；用imagej对克隆数进行统计；柱形图代表3个独立实验的数据，误差线表示平均值(sd)的标准误差，**p，***p，****p分别表示p《0.01，p《0.001，p《0.0001，a，b two-wayanova分析，c，d one-wayanova withtukey’s multiple comparisons)。
27.图10为在低氧和常氧条件下，rnf122通过hif1α抑制mda-mb-231细胞迁移和侵袭，其中a和b为transwell实验验证常氧和低氧(1％o2)条件下ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231细胞迁移影响；c和d为transwell实验验证常氧和低氧条件下ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231细胞侵袭影响；用imagej对迁移和侵袭细胞数进行统计；柱形图代表3个独立实验的
数据，误差线表示平均值(sd)的标准误差，***p，****p分别表示p《0.01，p《0.001，p《0.0001，one-wayanovawith tukey’smultiple comparisons)。
具体实施方式
28.本发明提供了一种检测rnf122表达量的试剂在制备诊断肿瘤发生或肿瘤预后评价的试剂中的应用。
29.在本发明中，所述rnf122优选包括rnf122基因和/或rnf122蛋白。检测rnf122基因表达量的试剂优选包括qpcr扩增引物。所述qpcr扩增引物优选包括核苷酸序列如seq id no:9(tgctcagccttatcttct)所示的正向引物和核苷酸序列，如seq id no:10(taactcatccttcccctt)所示的反向引物。所述试剂优选还包括qpcr扩增混合液和反转录试剂。所述诊断肿瘤发生或肿瘤预后评价的方法，优选提取待测组织rna，经反转录，得到cdna为模板，用所述引物进行qpcr扩增和分析，与健康人乳腺组织rnf122 mrna表达量相比，结果呈显著降低时，预测可能有肿瘤发生的风险，后续结合其他诊断措施综合判断。
30.在本发明中，检测rnf122蛋白表达量的试剂优选包括抗rnf122蛋白抗体。优选利用蛋白质免疫印迹分析或免疫组化检测rnf122蛋白表达量。本发明对具体检测方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的相应分析方法即可。所述抗rnf122蛋白抗体购自sigma公司，公司货号sab2106624及novus公司货号分别为nbp1-74191和nbp-82295。
31.在本发明实施例中，所述肿瘤优选包括乳腺癌。通过蛋白质免疫印迹分析，相比正常乳腺组织，rnf122在乳腺癌组织中低表达，组织芯片免疫组化发现rnf122在乳腺癌病人组织中低表达(p＝0.0023)。通过tcga数据库分析发现rnf122不仅在乳腺癌中低表达(p＝0.000129)，而且存在缺失突变。同时对乳腺癌患者生存分析表明，高表达rnf122的乳腺癌患者总生存期更长(p＝0.0244)。可见，rnf122低表达可用于早期肿瘤的诊断，rnf122高表达可用于肿瘤预后效果评估。
32.本发明提供一种提高rnf122基因或蛋白表达水平的试剂在制备抗肿瘤药物和/或抗肿瘤转移药物中的应用。
33.在本发明中，所述抗肿瘤优选包括肿瘤细胞的生长和/或克隆。所述抗肿瘤转移优选包括抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力、抑制肿瘤细胞对葡萄糖的摄取和抑制血管生成。
34.在本发明中，所述肿瘤优选包括乳腺癌。在本发明实施例中，验证了在细胞水平上经过生长曲线实验验证，rnf122基因或蛋白高表达能够有效抑制肿瘤细胞的生长、克隆形成和增殖能力，同时在动物水平上开展异种移植瘤实验证明，过表达rnf122的肿瘤细胞在裸鼠中肿瘤大小和重量受到抑制，生长速度也十分缓慢；transwell实验探究rnf122对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响，过表达rnf122抑制mda-mb-231乳腺癌细胞的转移和侵袭能力。在低氧条件下，rnf122基因或蛋白负向调控hif-1α表达，因此所述药物具有负向调控hif-1α表达的作用。
35.本发明提供了抑制hif-1α转录活性的试剂在制备抑制与增殖、转移、代谢和血管内生成相关的靶基因转录的试剂盒中的应用，所述抑制hif-1α转录活性的试剂包括rnf122基因或蛋白。
36.在本发明中，所述rnf122基因优选以过表达rnf122基因重组载体形式存在于与试剂盒中。所述过表达rnf122基因重组载体以慢病毒介导感染人或动物中，使rnf122基因在
动物体内过表达，从而达到抑制hif-1α转录活性。所述rnf122蛋白优选以重组蛋白的形式添加到试剂盒中。所述重组蛋白通过注射形式提高其在动物体内表达量。
37.下面结合实施例对本发明提供的rnf122在制备抗肿瘤药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.材料来源及配制说明
39.1.材料
40.1.1.细胞系
41.hek293t细胞购于atcc细胞库，培养条件：dmem含10％fbs，培养于恒温37℃，5％co2的孵箱。mcf7细胞购于atcc细胞库，培养条件：90％mem含10％fbs及0.01mg/ml人胰岛素，培养于恒温37℃，5％co2的孵箱。mda-mb-231细胞购于atcc细胞库，培养条件：90％l15含10％fbs，培养于恒温37℃，无co2的孵箱。
42.1.2试剂及耗材
43.1.2.1质粒构建相关试剂：
44.max dnapolymerase(takara)、t4dnaligase(takara)、pcr引物、axyprep质粒dna小量试剂盒(axygen)、axyprep dna凝胶回收试剂盒(axygen)、axyprep质粒中量制备试剂盒(axygen)、reverse-trans-scribed with superscript iii kit(takara)、trizol(invitrogen)、agarose(coolaber)、限制性内切酶(takara)、dh5α感受态细胞(生工生物工程(上海)股份有限公司)、dnamarker(takara)、gelstain(上海翊圣生物科技有限公司)。
45.1.2.2细胞培养和病毒包装相关试剂：
46.dmem培养基(thermofisher)、mem培养基(hyclone)、l15培养基(macgene)胎牛血清(gibco)、细胞冻存液(新赛美生物科技有限公司)、0.25％胰蛋白酶(gibco)、puromycin(invivogen)、polybrene(sigma)、pax2、pmd2(实验室保存质粒)、lipo2000(thermofisher)、滤器(0.45μm millipore)、各规格细胞培养皿和培养瓶、离心管、冻存管(thermo)。
47.1.2.3westernblot相关试剂：
48.ripa细胞/组织裂解液(碧云天)、pmsf(takara)、na3vo4磷酸酶抑制剂(sigma)、cocktail蛋白酶体抑制剂(sigma)、bca法测蛋白浓度试剂盒(碧云天)、5
×
sds-page蛋白上样缓冲液(新赛美)、30％acr-bis(29:1)(碧云天)、过硫酸铵(amresco)、temed(碧云天)、10％sds(碧云天)、1mtris-hcl，ph6.8(碧云天)、1.5m tris-hcl，ph8.8(碧云天)、triton-x 100(amresco)、tween-20(amresco)、预染蛋白marker(thermofisher)、10
×
pbs(takara)、一抗稀释液(碧云天)、脱脂牛奶(bd)、兔二抗(thermo fisher)、鼠二抗(thermo fisher)、各规格离心管(eppendorf)、配胶玻璃板、梳子、滤纸(bio-rad)、、pvdf膜、化学发光底物(millipore)、nacl、kcl、na2hpo4·
12h2o、kh2po4(国药)。
49.1.3仪器和设备
50.梯度pcr仪(ab veriti 96wellthermal cycler)、恒温细胞培养箱(thermofisher)、酶标仪(tecan)、高速冷冻离心机(eppendorf)、生物安全柜(thermo fisher)、凝胶成像仪(tanon)、垂直电泳槽(bio-rad)、转膜槽(bio-rad)、化学发光成像系统(sagecreation)、nanodrop 2000c(thermo scientific)、微量移液器(eppendorf)、常温
离心机(安徽中科中佳)、多功能酶标仪(perkin elmer)、流式细胞仪(bd)、-80℃超低温冰箱(thermo scientific)、微波炉(midea)、脱色摇床(大连竞迈生物科技有限公司)、恒温金属浴(上海一恒)。
51.1.4常用溶液配制
52.1.4.110
×
sds-page电泳缓冲液(1l)：称取tris-base：30.3g；glycine144g；sds 10g，溶于ddh2o，充分搅拌溶解，定容至1000ml。
53.1.4.210
×
转膜缓冲液：称取30.3g tris-base、144g甘氨酸溶于800ml蒸馏水，磁力搅拌器上使其充分溶解，定容至1l，置于室温备用。使用期稀释为1
×
并补充20％甲醇，置于4℃保存备用。
54.1.4.3lb液体培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶于800ml蒸馏水中，充分溶解后，加入naoh调节ph至7.0，定容至1l。高温高压蒸汽灭菌，置于4℃保存备用。
55.1.4.4amp固体培养板：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，7.5gagar溶于800ml蒸馏水中，充分溶解后，加入naoh调节ph至7.0，定容至1l。高温高压蒸汽灭菌，待温度降至50℃加入1mlamp，混匀倒板。冷凝后置于4℃保存备用。
56.实施例1
57.一、rnf122基因过表达重组载体、敲降crispr cas9载体及hif-1α过表达重组载体构建方法
58.1.1引物设计与扩增方法
59.rnf122基因过表达，敲降crispr cas9克隆及hif-1α过表达克隆引物设计如表1和表2，空载质粒作为对照。引物合成是由金唯智生物工程有限公司完成。
60.表1 rnf122基因过表达载体构建设计的引物
[0061][0062][0063]
表2hif-1α过表达重组载体构建设计的引物
[0064][0065]
1.2载体酶切及连接
[0066]
1)pcdh载体构建
[0067]
a)rnf122目的基因按照如下体系扩增得到：
[0068][0069]
pcr反应条件：
[0070]
将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，并确定目的基因分子量大小，进行切胶回收。
[0071]
b)酶切载体和基因片段
[0072]
首先对上述rnf122基因扩增产物进行nheⅰ酶切，反应体系如表3所示：
[0073]
表3酶切反应体系
[0074][0075][0076]
上述产物进行pcr回收，后继续用bamhⅰ酶切，体系如表4：
[0077]
表4酶切反应体系
[0078][0079]
酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化，得到最终连接用产物。
[0080]
c)连接：将酶切好的载体与片段进行连接，按照之前所述连接体系16℃连接3h。
[0081]
1.3质粒转化与扩增
[0082]
混合孵育：50μltrans5a感受态中加入目的连接产物5μl，吹打混匀，冰上放置30min。
[0083]
热激：42℃水浴热激45秒后，冰上2min。
[0084]
培养：加入不含抗生素的500μl的lb液体培养基，37℃摇床培养1h。
[0085]
涂板：室温短暂离心，弃上清，用移液器吹打混匀沉淀加到含氨苄青霉素的lb固体琼脂板上，用灭菌的玻璃珠混匀菌液，20min后，37℃培养箱倒置培养过夜。
[0086]
挑单菌落：在8连排pcr管中放入适量灭菌水，另一8连排按下面的体系混成大样后加入其中，待12～14小时后，取出菌板，用无菌枪头挑取大小适当的单一菌落，分别在上述8连排中蘸取。
[0087]
阳性克隆鉴定：
[0088]
按照之前基因的扩增体系混大样，反应循环数降到25个循环，待扩增完成后，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，并依据目的基因分子量大小，挑选对应的阳性菌液进行摇菌提质粒，阳性的菌落即可放入15ml离心管中加入lb培养基及抗生素，放至37℃摇床扩增菌落，12-16小时进行质粒提取。酶切鉴定正确后送测序确认序列是否正确。
[0089]
二、稳定细胞系构建
[0090]
1慢病毒制备
[0091]
1)准备细胞：转染前24h，将适量的hek-293t细胞接种至10cm培养皿，保证第二天转染时细胞密度达到80～90％，用含10％fbs新鲜的dmem完全培养基培养。
[0092]
2)转染：将1.5ml opti-mem培养基于洁净无菌的15ml离心管中与7.5μg pspax2质粒、2.5μg pmd2质粒和10μg目的质粒(上述制备的过表达rnf122基因的重组质粒或hif-1α过表达)混匀。同时取60μl转染试剂lipoplus和1.5ml opti-mem混合，室温静置5min后，加入15ml离心管，轻柔混匀，室温静置20min。将上述混合液加入培养皿中，轻轻摇匀。
[0093]
3)收集病毒：12～16h后，将转染后的hek293t细胞传至15cm细胞培养皿中，用含10％fbs新鲜的dmem完全培养基培养。培养48小时后，收集培养皿内培养基到15ml离心管中，1500rpm离心5min。用0.45μm滤膜过滤离心管内离心得到的上清液，即为含病毒颗粒的培养基，分装至无菌ep管，-80℃保存。
[0094]
2慢病毒感染及筛选
[0095]
1)准备细胞：感染前24小时，将试验细胞接种至6孔板，保证转染时细胞密度达到
70～80％。
[0096]
2)换液：转染时，弃尽原培养液，加入1mlmem培养基/l15培养基。
[0097]
3)加病毒液：将1ml的病毒液加入六孔板内的培养基中，加入促转染剂polybrene(终浓度8μg/ml)，混匀放入孵箱培养。转染24小时后，将含有病毒的培养液倒入含有84的废液桶中，并将细胞传至10cm皿培养。
[0098]
4)筛选：传代24小时左右，待细胞密度达到70～80％，用含浓度为2μg/ml嘌呤霉素的10％fbs mem/l15培养基培养。维持嘌呤霉素2μg/ml，连续培养5天。
[0099]
5)验证、冻存：收集适量细胞提取蛋白，westernblot验证稳转细胞系目的基因的敲降效率，冻存稳定表达细胞。
[0100]
实施例2
[0101]
蛋白质免疫印迹(westernblot实验)分析肺癌患者正常组织与肿瘤组织rnf122表达情况
[0102]
以14例肺癌患者正常组织与肿瘤组织为材料进行如下操作：
[0103]
1提取细胞总蛋白及浓度定量
[0104]
取对数生长期细胞置于冰上，用pbs清洗3遍，加入适量ripa裂解液(提前加入磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂)，用细胞刮收集细胞转入1.5ml离心管中，冰上裂解30min，期间多次震荡，使其充分裂解。然后4℃12000rpm离心15min，取上清进行蛋白定量或-80℃保存备用。蛋白定量采用bca法，按照试剂盒说明书操作。
[0105]
2聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0106]
制胶：配制10％的下层分离胶(30％聚丙烯酰胺、ph8.8 tris-hcl、10％aps、10％sds、temed)和5％的上层浓缩胶(30％聚丙烯酰胺、ph6.8tris-hcl、10％aps、10％sds、temed)，凝固后拆下凝胶玻璃板，拔出梳子，蒸馏水冲洗胶孔去除残留胶粒。将玻板固定于电泳装置内，加入电泳缓冲液，并用移液枪再次吹打每个胶孔。取20-30μg细胞总蛋白，加入上样缓冲液，混合均匀，95℃煮5min，使其充分变性。冷却并离心，缓慢加入上样孔。浓缩胶阶段80v电泳30min后，调节电压至100v至溴酚蓝移动到玻板最底部，电泳结束。
[0107]
3蛋白质转移至nc膜
[0108]
采用bio-rad湿转装置，槽子内从下到上顺序依次为两层网格板，负极板，一层网格板，三层海绵，滤纸，sds-page胶，nc膜，滤纸，两层海绵，一层网格板，正极板，塑料板放入转膜的槽子内上，使用电压0.8a转膜90min。
[0109]
4封闭、抗体孵育、显色
[0110]
将转膜后的nc膜置于封闭液(含5％脱脂奶粉的pbs溶液)中，室温封闭1小时。根按照抗体使用说明书用3％bsa的pbst溶液稀释一抗，4℃过夜孵育。用pbst(1
×
pbs中加入0.1％tween-20)洗3次，每次5min。按照抗体使用说明书用3％bsa的pbst溶液稀释相应二抗，室温孵育1h。后用tbst洗膜3次，每次5min。使用ecl发光试剂盒中的a液和b液等量混合，并将混合液均匀滴加的pvdf膜上。室温作用2min，用化学发光成像系统(sagecreation)检测特异性条带。
[0111]
同时以免疫组织化学染色分析肺癌患者正常组织与肿瘤组织rnf122表达情况
[0112]
以14例肺癌患者正常组织与肿瘤组织为材料进行如下操作：
[0113]
1脱蜡水化：，浸入二甲苯i、ii各5min。取出切片置于100％无水乙醇i、ii
→
95％乙
醇
→
70％乙醇
→
50％乙醇各2min。用pbs冲洗三次，每次3min
[0114]
2抗原修复：(1)抗原置于0.01m sodium citrate中高档微波5min，取出室温放置20min不开盖，再将修复液放置于中高档微波3min，室温放置15min开盖，pbs冲洗三次，每次3min。
[0115]
3清除内源性过氧化氢酶：3％h2o2(pbs)室温30min，pbs冲洗三次，每次5min。
[0116]
4湿盒封闭1小时：
[0117][0118]
5一抗孵育：封闭液稀释一抗，4℃湿盒中过夜(用封口膜盖上)，blocking buffer用pbs1：10稀释后洗3次，每次10min。
[0119]
6二抗孵育，滴加1滴二抗b液到组织上，室温孵育1小时，然后pbs洗三次，每次5min。
[0120]
7iii抗孵育，滴加1滴iii抗试剂盒c液到组织上，室温孵育1小时，然后pbs洗三次，每次5min。
[0121]
8dab显色，滴加预备好的新鲜的显示剂dab工作液，室温孵育，显示3-5min，光镜观察控制显色时间，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显示。
[0122]
9苏木精染核：苏木精染色3min，自来水冲洗，然后pbs冲洗，50％-100％各级酒精脱水，每级3min，最后置于二甲苯透明两次，每次3min。滴加中性树脂封片，通风橱中干燥。
[0123]
结果
[0124]
通过乳腺癌组织芯片免疫组化发现，rnf122在乳腺癌病人组织中低表达(图1中a)。蛋白质免疫印迹分析14例肺癌患者正常组织与肿瘤组织rnf122表达情况，结果表明rnf122在乳腺癌组织中低表达(图1中b)。
[0125]
本发明利用tcga数据库分析发现rnf122不仅存在缺失突变，而且在乳腺癌样本中低表达(p＝0.000129)，且高表达rnf122的乳腺癌患者总生存期更长(p＝0.0244)(图1中c-e)。
[0126]
实施例3
[0127]
rnf122抑制乳腺癌细胞体外和体内增殖
[0128]
1.为了探究rnf122在乳腺癌细胞中作用，在mcf7和mda-mb-231乳腺癌细胞中构建了rnf122高表达及低表达的稳定细胞系(方法见实施例1)，进行平板克隆实验，具体方法如下：
[0129]
取对数期mda-mb-231ctl及rnf122稳转细胞经过酶解，计数，铺至中皿各2000个细胞，铺两组一组三个重复，待贴壁后一组常氧孵箱培养，一组放至含1％o2(低氧)培养室培养，15天左右收，期间每隔3天更换新鲜培养基。观察细胞，当培养皿内出现肉眼可见的克隆，弃去培养液，pbs清洗2次。加入4％多聚甲醛，室温固定15min。弃固定液，pbs清洗1次，加
入0.1％结晶紫染15min。流水缓慢洗去染色液，倒扣培养皿室温干燥。拍照并统计克隆数目。
[0130]
通过平板克隆实验表明无论在常氧或低氧条件下过表达rnf122都可以抑制乳腺癌细胞增殖(图2中a和图3中a)，而敲降rnf122可以促进乳腺癌细胞增殖(图2中c和图3中c)。
[0131]
2.通过生长曲线实验验证常氧或者低氧条件下过表达rnf122对乳腺癌细胞增殖的影响，具体细胞生长曲线测定方法如下：
[0132]
取对数生长期细胞用胰酶消化后离心，用培养液重悬，进行细胞计数。以每孔5000个细胞的浓度接种于24孔板中，每种细胞接种3个复孔，分别接种两组，置于37℃，5％co2孵箱内培养箱中培养过夜。从第二天开始计数，第一次计数结束后将一组细胞置于37℃，5％co2，1％o2低氧培养室，每隔1天进行细胞计数，最后将细胞数目做出生长曲线图。具体为将mda-mb-231ctl及rnf122稳转细胞铺24孔板中每个孔2000个细胞。一组常氧条件培养，一组低氧条件培养，每隔一天数细胞进行细胞增殖计数。
[0133]
结果表明，无论在常氧或者低氧条件下过表达rnf122可以抑制乳腺癌细胞增殖(图2中b和图3中b)，而敲降rnf122可以促进乳腺癌细胞增殖(图2中d和图3中d)。
[0134]
3.裸鼠体内移植瘤实验，将mcf7和mda-mb-231rnf122过表达和对照稳转细胞(不包含rnf122基因的慢病毒侵染细胞)注射到裸鼠皮下来观察细胞成瘤的能力。针对mcf7稳转细胞我们每只老鼠注射了500万个细胞，而且在注射后直至长瘤前我们每天都给裸鼠涂抹雌激素来促进肿瘤的长成，肿瘤生长之后每隔一天涂抹一次即可。具体方法如下：选取4-6周龄裸鼠，进行随机分组。rnf122过表达体内验证实验：将rnf122过表达的mcf7稳转细胞系，按照5
×
106/100μl/只的细胞量接种到裸鼠腋窝侧表皮下面，注射完后每天给裸鼠颈部涂抹0.1m的β-雌激素，观察到长瘤子后可以每隔一天涂抹一次。肿瘤大小测量为每隔2天一次，用游标卡尺测量皮下肿瘤最长直径(l)和垂直方向最大横径(w)。将rnf122过表达的mda-mb-231稳转细胞经消化计数后用无血清培养基重悬，按照1
×
106/100μl/只的细胞量接种到裸鼠腋窝侧表皮下面，在接种完细胞两周后开始观察皮下成瘤情况，肿瘤大小测量为每隔2天一次，用游标卡尺测量皮下肿瘤最长直径(l)和垂直方向最大横径(w)。
[0135]
结果如图4中a～c所示。通过观察瘤的最终大小和增长曲线，rnf122组的瘤重要比对照组轻，而且肿瘤的生长速度也明显比对照组慢。mda-mb-231的过表达稳转细胞我们每只老鼠注射了100万个细胞。如图4中d～f所示，无论是从瘤重还是瘤的生长体积曲线分析，均证明rnf122过表达明显抑制了裸鼠的成瘤能力。
[0136]
实施例4
[0137]
rnf122抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭
[0138]
利用过表达rnf122的稳转细胞系，通过细胞划痕实验及transwell(不铺基质胶与铺基质胶)实验探究在常氧或者低氧条件下rnf122对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。
[0139]
1.transwell细胞迁移、侵袭实验
[0140]
在24孔板中放入transwell小室(侵袭实验放入事先铺有matrigel的小室)，缓慢加入600μl含20％血清的培养基，取对数生长期细胞消化成细胞悬液，加入无血清培养基重悬，用细胞计数仪进行计数。迁移实验和侵袭实验每孔均匀加入含5万个细胞的悬液，每组三个复孔准备两组，一组置于37℃，5％co2孵箱内，一组置于37℃，5％co2，1％o2低氧培养室
内培养。迁移实验37℃培养箱培养24小时，侵袭实验37℃培养箱培养48小时。用结晶紫染色，用棉签去除上层未迁移的细胞，最后在显微镜下观察并拍照，利用imagej软件计算迁移的细胞数。
[0141]
2.细胞划痕实验验证rnf122对mda-mb-231迁移影响。mda-mb-231rnf122稳转细胞铺六孔板每孔50万个细胞，待细胞长满划痕，一组细胞放到低氧(1％o2)培养室生长，一组细胞常氧培养箱生长。
[0142]
结果表明，过表达rnf122抑制mda-mb-231乳腺癌细胞的转移(图5中a～e)和侵袭能力(图5中g～h)
[0143]
实施例5
[0144]
在低氧条件下rnf122下调hif-1α
[0145]
为了探究rnf122与hif-1α的关系，分别在两种乳腺癌细胞系mcf7和mda-mb-231mcf7细胞外源转染pcdna3.1-flag-rnf122及对照质粒，转染24h后将细胞分别放入低氧(1％o2)处理0、1、3、6、9、12小时，western blot验证hif-1α表达。
[0146]
结果如图6中a，b所示，在一定低氧时间范围内无论低氧处理几个小时，rnf122过表达都可以明显抑制hif-1α的蛋白表达。
[0147]
为了从机制上具体研究rnf122如何影响hif-1α的水平，检测rnf122是否与hif-1α相互作用。首先，在hek293t细胞中外源共转了flag-rnf122和ha-hif-1α进行co-ip实验，然后分别用flag珠子和与ha抗体孵育的珠子作为诱饵蛋白探究与另一蛋白是否相互作用。
[0148]
结果如图6中c，d所示。flag-rnf122可以与ha-hif-1α相互作用。同时，我们做了一组外源转染flag-rnf122转染24h后再低氧处理6h进行co-ip实验，然后分别用flag珠子和hif-1α珠子孵育，进一步证明flag-rnf122可以与内源hif-1α相互作用。
[0149]
实施例6
[0150]
rnf122通过泛素蛋白酶体途径降解hif-1α
[0151]
为了验证rnf122下调hif-1α的具体途径，在mcf7细胞中进行了蛋白稳定性实验。将mcf7和mda-mb-231细胞分别转染对照及pcdna3.1-3
×
flag-rnf22质粒，转染24h后用200μμcocl2先处理6h，再用50μg/ml chx分别处理0、30、60、120min。
[0152]
结果显示，过表达rnf122可以抑制hif-1α的半衰期(图7中a)。同时，用蛋白酶体抑制剂处理细胞后rnf122不再抑制hif-1α表达(图7中b)。
[0153]
接下来还通过泛素化实验，将对照和flag-rnf122及rnf122突变质粒分别于ha-hif-1α和his-ub共转到hek293t，转染24h再加200nm ps341处理6h，用flag做诱饵蛋白。结果表明，rnf122可以促进hif-1α泛素化(图7中c)。
[0154]
实施例7
[0155]
低氧条件下rnf122负向调控hif-1α转录活性
[0156]
已知hif-1α是重要的转录因子可以促进很多与肿瘤增殖、转移、代谢及血管生成等基因转录活性。通过利用荧光素酶报告系统实验验证低氧条件下rnf122过表达抑制hif-1α转录活性的影响，具体为将pgl3-hre reporter、renila与0、200、400和500ng flag-rnf122共转在mcf7细胞，转染24h后，一组常氧，一组低氧(1％o2)处理6h。
[0157]
在低氧条件下rnf122过表达抑制hif-1α转录活性，敲降rnf122会促进hif-1α转录活性(图8中a)。
[0158]
进一步利用葡萄糖摄取试剂盒进行验证，rnf122过表达或敲降mcf7稳转细胞低氧处理6h，按葡萄糖摄取检测试剂盒说明处理细胞，检测rnf122对mcf7葡萄糖摄取能力影响。具体方法为葡萄糖摄取水平通过glucose uptake colorimetricassay试剂盒(biovision)检测，在96孔板中铺3
×
104个细胞每孔，第二天移走培养基用pbs洗两次后加入无血清培养基饥饿过夜来增加葡萄糖摄取量，之后按照说明书进行处理和反应，用多功能酶标仪检测412nm吸光度，每隔5min检测一次直到标准品的吸光度值达到1.5～2.0od。
[0159]
在低氧条件下rnf122过表达会抑制mcf7细胞对葡萄糖的摄取能力，敲降rnf122促进mcf7对葡萄糖摄取(图8中b)。
[0160]
进一步通过利用人脐静脉血管上皮细胞进行血管形成实验，具体方法如下：1)准备条件性培养基：mcf7及mda-mb-231rnf122过表达和对照稳转细胞铺至六孔板中，37℃，5％co2孵箱内培养48h后再放入低氧培养室中培养12h。最后收集培养基作为条件性培养基。
[0161]
2)准备huvec(人脐静脉上皮细胞)：提前至少半小时在24孔板中铺上基质胶，然后将24孔板放到37℃，5％co2孵箱内。消化huvec细胞并进行细胞计数，每隔孔中铺6
×
104个细胞然后放回37℃，5％co2孵箱内培养1h左右可贴壁，细胞贴壁后更换成条件性培养基继续培养。随时观察细胞网络，一般12h以内。
[0162]
3)染色：用pbs配制2μg/ml calceinam，每孔加入1ml 37℃，5％co2孵箱内培养30min即可进行拍照。
[0163]
将mda-mb-231ctlrnf122稳转细胞低氧(1％o2)处理12h后收集培养基作为条件性培养基培养huvec细胞，结果表明在低氧条件下rnf122过表达抑制血管形成(图8中c)。
[0164]
实施例8
[0165]
rnf122通过调控hif-1α的表达来抑制乳腺癌增殖、迁移和侵袭
[0166]
为了进一步验证rnf122与hif-1α的关系，在常氧和低氧(1％o2)处理条件下，采用生长曲线实验验证了ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231细胞增殖影响。在过表达rnf122的细胞中回复hif-1α的表达可以回复rnf122对乳腺癌细胞生长的抑制作用(图9中a，b)。
[0167]
采用平板克隆实验验证在常氧和低氧处理条件下ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231克隆形成能力影响，每孔铺2，000个细胞，共长15天。结果表明平板克隆形成能力的抑制作用(图9中c，d)。
[0168]
采用transwell实验验证在常氧和低氧(1％o2)条件下ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231细胞迁移影响。采用transwell实验验证在常氧和低氧条件下ctl1+ctl2、ctl1+ha-hif-1α、rnf122+ctl2、rnf122+ha-hif-1α对mda-mb-231细胞侵袭影响。
[0169]
结果表明，在过表达rnf122的细胞中回复hif-1α的表达可以回复rnf122对乳腺癌细胞的迁移(图10中a，b)和侵袭的抑制(图10中c，d)。
[0170]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。