一种参与不定根发育的白桦BpPIF4基因及其应用

一种参与不定根发育的白桦bppif4基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种参与不定根发育的白桦bppif4基因及其应用。


背景技术：

2.pifs家族蛋白作为一种重要的bhlh(basichelix-loop-helix)类型转录因子，其主要特点是能与光敏色素(phytochrome，phy)发生相互作用。通过系统进化分析发现pifs蛋白隶属于bhlh转录因子家族第15亚家族，该家族的成员除pifs外还包括具有光形态建成功能的hfr1(long hypocotyl infar-red 1)和pil1(phytochrome interacting factor3-like 1)因子、具有调控种子萌发功能的spatu-la(spt)和未被鉴定功能的其他5种bhlh蛋白。研究表明，pif1、pif3及pif4不仅可以形成同源二聚体行使功能，pif3还能够与pif4或pif1形成异源二聚体，共同结合靶基因启动子的g-box元件来调节下游基因的转录，而pif4和pif5还能分别与hfr1形成异二聚体调控hfr1在避荫性反应中的蛋白水平。在植物体内，br途径中的受体蛋白bzr1(brassinazole-resistant 1)可以与pif4形成异源二聚体共同调控相关基因的表达促进植物生长；而ga途径中的负调控因子della蛋白可以通过与pif3及pif4的dna结合域相互作用的方式抑制pif3和pif4行使转录调控的功能。在植物体内，br途径中的受体蛋白bzr1(brassinazole-resistant 1)可以与pif4形成异源二聚体共同调控相关基因的表达促进植物生长；而ga途径中的负调控因子della蛋白可以通过与pif3及pif4的dna结合域相互作用的方式抑制pif3和pif4行使转录调控的功能。迄今pifs基因的研究多数集中在植物光形态建成方面，而其在不定根发育中的功能研究极少，且多数以模式植物拟南芥等作为实验材料，对于pifs基因在具有较长幼龄期的多年生木本植物白桦中的功能尚不清楚。


技术实现要素：

3.为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
4.本发明提供了一种参与不定根发育的白桦bppif4基因，所述白桦bppif4基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.本发明还提供了一种所述的白桦bppif4基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.本发明还提供了一种包含所述的白桦bppif4基因的表达载体。
7.本发明还提供了一种所述的白桦bppif4基因、所述的蛋白质或所述的表达载体在调控白桦不定根性状中的应用。
8.优选的，所述白桦不定根性状包括白桦不定根的数量和长度。
9.本发明利用分子生物学的手段，构建bppif4基因的过表达和抑制表达载体，利用农杆菌侵染法对白桦进行遗传转化，筛选出过表达和抑制表达转基因株系后对其表型、性状进行分析统计，从而确定白桦bppif4基因参与白桦不定根的发育，对bppifs基因功能进
行了补充。
10.本发明的研究结果表明，bppif4基因能够调控白桦不定根的生长，影响不定根的数量和根长。本发明为今后利用转基因技术对林木不定根发育进行调控，培育能够快速无性繁殖的林木提供了基因资源，同时为利用基因工程技术调控不定根的形成提供理论依据，具有很大的应用价值。
11.本发明还提供了调控植物不定根发育的bppif4蛋白，可用于调控林木不定根发育，培育能够快速无性繁殖的林木，并且可用于搜寻在其他植物中与不定根发育相关的基因。本发明还提供的含有白桦bppif4基因重组载体，可有效负调控植物不定根发育。本发明还提了的bppif4基因在调控白桦不定根性状中的应用，具有调控不定根发育，参与植株形态建成的功能，可用于林木植物不定根发育研究中，并为植物pif基因家族功能研究提供参考资源。
附图说明
12.图1为实施例1中白桦bppif4基因全长的pcr扩增电泳图；
13.图2为实施例2中植物表达载体pbi121图谱；
14.图3为实施例2中bppif4基因连接pbi121-gfp表达载体菌液pcr鉴定；
15.图4为实施例2中bppif4-srdx连接pbi121-gfp表达载体菌液pcr鉴定；
16.图5为35s::bppif4-gfp转基因白桦中bppif4表达水平检测；
17.图6为35s::bppif4-srdx转基因白桦中bppif4表达水平检测；
18.图7为bppif4转基因白桦生根比较，其中a为不定根生长状态；b为不定根数量；c为不定根长度。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
20.实施例1白桦bppif4基因的克隆
21.(1)植物材料的获得
22.实验材料野生型组培白桦，取自东北林业大学生物学实验室。采集后立即冷藏到-80℃冰箱保存备用。
23.(2)白桦rna的抽提
24.白桦总rna使用ctab法步骤进行，使用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测总rna的纯度和浓度。
25.用thermoscript
tm rt-pcr system反转录试剂盒合成cdna第一链，作为扩增模板，然后用引物bppif4-f和bppif4-r进行pcr扩增，引物序列如下：
26.正向引物：bppif4-f:ctagtctagaatgaatcgttgctttcctg；
27.反向引物：bppif4-r:ggcccgggcaaaacaggt。
28.pcr反应体系：cdna模板1μl，10
×
buffer 5μl，dntp(2.5mm)5μl，正反向引物各1.5μl(10μm)，kod plus neo dnapolymerase 1μl，灭菌蒸馏水补足50μl。
29.pcr扩增条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸90s，35个
循环；68℃延伸5min。
30.pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳图如图1所示，然后回收目的条带，命名为白桦bppif4基因。
31.按照说明书操作在白桦bppif4基因上连接a尾，将胶回收产物与克隆载体pmd18-t连接，连接体系如下：取0.5μlpmd18-tvector，5μl solution i，2μl胶回收产物，补加无菌去离子至10μl，轻轻混合均匀，4℃过夜连接后转化大肠杆菌，提取质粒并测序。测序结果显示：白桦bppif4基因序列长为1443bp，核苷酸序列如seq id no.1所示，利用测序转录组数据库，获得白桦bppif4基因。
32.对白桦bppif4基因编码的蛋白质序列分析：bppif4基因总共编码480个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示。使用expasy下的protparam分析bppif4蛋白的基本理化性质，其中包括相对分子量、等电点、氨基酸组成、原子组成等参数。预测结果显示，bppif4蛋白的分子式为c
2277h3561n671o737s28
，分子量为53026.06da，氨基酸总数480个，理论等电点为6.08，为酸性蛋白质，不稳定指数为64.41(》40)，属于不稳定蛋白，ser、gln、gly、pro含量丰富。
33.使用在线预测软件smart对bppif4蛋白进行结构域分析。分析结果显示bppif4蛋白包含4个低复杂程度区域及一个hlh结构域。
34.实施例2白桦bppif4基因的植物表达载体构建
35.(1)以实施例1扩增得到的白桦bppif4基因序列为模板，利用引物对bppif4-f和bppif4-r扩增，得到携带xba i酶和xma i酶酶切位点的bppif4基因片段；同时，利用引物对bppif4-srdx-f和bppif4-srdx-r扩增，得到携带spe i酶和xma i酶酶切位点的bppif4基因片段。
36.正向引物：bppif4-f:ctagtctagaatgaatcgttgctttcctg；
37.反向引物：bppif4-r:ggcccgggcaaaacaggt。
38.正向引物：bppif4-srdx-f:gactagtatgaatcgttgctttcctga；
39.反向引物：bppif4-srdx-r:
40.ggcccgggtcaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatccagcaaaacaggt。
41.(2)使用天根质粒小提试剂盒提取pbi121-gfp大肠杆菌质粒。
42.(3)将pbi121-gfp载体和携带xba i酶和xma i酶酶切位点的bppif4基因片段用xba i酶和xma i酶进行双酶切，以获得过表达载体pbi121-bppif4-gfp；同时，将pbi121-gfp载体和携带spe i酶和xma i酶酶切位点的bppif4基因片段用spe i酶和xma i酶进行双酶切，以获得抑制表达载体pbi121-bppif4-srdx。酶切体系均按照如下体系配置：
43.酶切体系50μl：基因胶回收产物：43μl，cut smart buffer 10
×
：5μl，内切酶1：1μl，内切酶2：1μl。酶切产物进行电泳及回收纯化后，使用t4连接酶进行连接反应。连接体系10μl：t4 buffer 10
×
：1μl，t4 dnaligase：1μl，基因酶切纯化产物：4μl，载体酶切纯化产物：2μl。
44.(4)将两种连接产物转化大肠杆菌，挑取数个单克隆进行菌液pcr鉴定，结果如图3、图4所示。从图3中可以看出，鉴定出3个pbi121-bppif4-gfp阳性克隆菌株，分别是2、3、16号菌株。从图4可以看出，鉴定出8个pbi121-bppif4-srdx阳性克隆菌株。因此，本实施例成功构建得到了过表达载体pbi121-bppif4-gfp和抑制表达载体pbi121-bppif4-srdx。将鉴
定得到的阳性菌液送至生物有限公司测序，并保存测序正确的菌液。
45.实施例3白桦bppif4基因在白桦中表达功能分析
46.(1)白桦无菌苗的培养
47.用wpm固体培养基(称取wpm粉末4.28g，硝酸钙1.12g，蔗糖40g，加水定容至2l，调节ph至5.8～6.0，每瓶培养瓶中添加琼脂0.8g/100ml，高压灭菌)培养野生型白桦组培苗。剪取无菌外植体移到有wpm培养基的培养瓶中(此过程均在无菌超净工作台中完成)，放在植物组织培养室培养26℃光照培养两个月。
48.(2)农杆菌介导的叶盘法转化白桦
49.a.农杆菌菌液的制备：挑取实施例2中测序成功的两种单克隆放于2ml液体lb培养基中28℃180rpm过夜培养，当菌液od600＝1.0时，将菌液稀释20倍，28℃180rpm过夜培养。直至菌液od600＝0.8，离心后弃上清，用液体wpm培养基重悬菌体(液体wpm培养基添加体积与离心前的菌液体积一致)作为两种侵染工程菌液。
50.b.外植体的选择：选取步骤(1)中无菌组培苗叶片深绿、叶面积较大的叶片，分为三组，分别为野生型组、过表达组、抑制表达组用于后续试验。
51.c.外植体的切割：在距离叶柄0.5cm处和叶柄基部切割叶片，切割时尽量保证叶片完整，不受其他外力损伤(野生型组进行同样的切割但不侵染)。
52.d.侵染：将过表达组、抑制表达组切割完成的叶片放入各自的工程菌液中，浸泡5min，然后用镊子取出叶片并用滤纸吸干多余菌液。
53.e.共培养：将侵染后的叶片放入共培养培养基(固体wpm培养基+6-ba2.0mg/l+naa 0.2mg/l))，26℃避光培养3天。
54.f.脱菌及选择培养：在无菌水中清洗叶片，清洗时置于水平摇床充分接触，每次5min，用无菌滤纸吸干表面多余水分，重复4次，再用含有400mg/lcef的无菌水中清洗叶片5次，每次10min，其他步骤同上，最后将三组的叶片置于脱分化培养基(固体wpm培养基+6-ba 2.0mg/l+naa 0.2mg/l+50mg/lkan+400mg/l cef)中光照培养，3天更换一次培养基。
55.g.再分化培养：将培养得到的愈伤组织转入再分化培养基(固体wpm培养基+6-ba 0.8mg/l+naa 0.02mg/l+ga30.5 mg/l+50mg/l kan+400mg/l cef)中，进行再分化培养。
56.h.抗性苗筛选：将分化的幼苗转入含50mg/l卡那霉素的生根培养基(固体wpm培养基+0.4mg/l iba)进行培养。
57.(3)抗性植株的qrt-pcr检测
58.通过ctab法提取抗性苗植株rna，反转录后的cdna作为模板进行qrt-pcr鉴定，18s为内参引物，bppif4基因特异性定量引物进行qrt-pcr检测，引物序列为：
59.正向引物：qbppif4-f：ggagggaaagagtcggttgg；
60.反向引物：qbppif4-r：agcagaagtcccaacaccat。
61.经抗性筛选及qrt-pcr检测最终得到12个过表达转基因阳性株系oe-12、oe-17、oe-18、oe-20、oe-23、oe-24、oe-25、pf-4、pf-5、pf-6、pf-7、oe-a(如图5所示)，和5个抑制表达转基因株系35s::bppif4-srdx-a、35s::bppif4-srdx-d、35s::bppif4-srdx-q、35s::bppif4-srdx-s、35s::bppif4-srdx-t(如图6所示)。
62.选择上述bppif4基因表达水平高的株系(过表达oe-25，抑制表达35s::bppif4-srdx-a)，观察生长5周的转基因白桦不定根生长状态，并对不定根数量及根长进行统计。结
果如图7所示。就生长状态来说，过表达转基因株系的不定根数量与野生型株系表型基本一致；bppif4基因过表达株系的不定根数量和野生型白桦相近，而bppif4基因抑制表达株系的不定根数量平均值仅为2.55根，而野生型株系的不定根数量则为3.625根，与野生型相比，35s::bppif4-srdx转基因白桦的不定根减少了29.5％；就不定根长度来说，野生型白桦的不定根长度均值为4.11cm，过表达株系的不定根平均长度为4.84cm，较野生型增长17.69％，而抑制表达株系的不定根长度仅为3.00cm，较野生型植株缩短26.97％，差异显著。因此，白桦bppif4基因参与不定根的发育过程，对不定根的生长具有促进作用。
63.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。