一种弧菌噬菌体及其应用的制作方法

1.本发明涉及海洋生物工程领域，特别是一种弧菌噬菌体及其应用。


背景技术：

2.水产养殖业是我国重要的农业活动之一，能够为全国提供优质的食粮，总蛋白贡献约为30%，同时为医药、化工、饲料等产业发展提供大量原料等。
3.在水产养殖活动中，弧菌病害是水产养殖的重要灾害之一。弧菌是一类革兰氏阴性，具有极生鞭毛，能运动，无芽胞和荚膜的短杆状细菌，其中有的弧菌有一定的弯曲，呈弧状或逗点状。部分弧菌是各种海洋生物的重要致病菌，引起的弧菌病流行面积广，发病率高。目前，已发现的对水产养殖鱼虾类具有致病性的弧菌有十几种，主要是副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌和哈维氏弧菌等，同时，也有部分弧菌对哺乳动物特别是人类具有致病性。弧菌病已经成为水产养殖业病害的最主要拦路虎，甚至达到“谈弧色变”的程度。弧菌在水产养殖中是长期存在的，将弧菌控制在一定的数量内是不需要处理的，但如果受到环境、水草、有害菌的影响就可能会刺激弧菌的迅速繁殖，污染水体，侵害养殖生物。
4.以2020年春为例，我国对虾苗种场出现严重的“玻璃苗”现象，该疾病首先在南方苗种场呈现爆发性趋势，并逐步在北方沿海一代蔓延，导致我国春季虾苗供应严重不足。4-6月份，中国水产科学研究院黄海水产研究所对5家育苗场共10个单元的养殖水体和虾苗胰腺组织进行检测，发现新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）的检出率最高，室内人工感染表明其致病性很强，而且能够对常用的抗生素如利福平、吡哌酸、链霉素、多粘霉素、青霉素、复方新诺明等有明显的耐药性。
5.弧菌病害防治一直是水产研究的重点。由于抗生素滥用，耐药细菌大量出现与流行，尤其近年来出现了一些“超级病菌”，它们几乎对所有的抗生素都不敏感，导致人类和动物对此类细菌的感染几乎无药可用，因此非常迫切需要新的抗感染武器来替代抗生素。在此背景下，人类把目光投向了噬菌体治疗。噬菌体作为一种新兴的微生态抗菌剂，因其具有替代抗生素治疗疾病的潜在可能，已受到越来越多的关注。许多研究表明，噬菌体用于治疗弧菌病取得了良好效果，例如在哈维氏弧菌存在的条件下使用噬菌体治疗的幼虾组存活率相较于空白对照组由10%提高到了40%；stalin等研究证实了在水产养殖系统中应用噬菌体可以作为预防和治疗对虾副溶血弧菌病的有效方式；li等运用“鸡尾酒疗法”将3株噬菌体等比例混合后用于治疗海参灿烂弧菌病的效果优于单株；sasikala等研究的噬菌体可以裂解 6 株溶藻弧菌，能有效控制溶藻弧菌的数量。而且，噬菌体有严格的宿主特异性，不会感染其他种属的生物（包括养殖生物），所以不会对除了其侵染对象以外的其他生物死亡，因此具有专一性和安全性。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供一种弧菌噬菌体；目的之二是提供一种该噬菌体的应用，以弥补现有技术的不足。
7.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：一种弧菌噬菌体，保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏号为：cctcc no：m 2022200，保藏日期为：2022年03月04日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072，分类命名为vibrio neocaledonicus phage vb_vne-09sg01。
8.所述噬菌体是一株能够特异性裂解新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）的长尾噬菌体，尾部长141
±
5 nm，头部约为81
±
2 nm左右的正二十面体；该噬菌体nf的潜伏期约为40 min，裂解期约为60 min；该噬菌体在ph 5-9、0-33.0
‰
、≤32℃下均能保持活性的相对稳定。
9.所述噬菌体（vb_vne-09sg01）在10
5 pfu/ml即达到较好的杀菌效果，在6 h内即可杀灭≥90%的弧菌；建议低温储存，但即使在32℃条件下处理24 h后仍有54.4%的噬菌体存活；最适ph为7-8，符合大部分海水养殖条件；对盐度的耐受性较广，适宜在盐度26.4-33.0
‰
条件下应用，在0
‰
的淡水条件下也有52.5%的噬菌体存活，即能够应用于河口至海水等养殖环境。
10.一种噬菌体制剂，包括其中噬菌体（vb_vne-09sg01），且总噬菌体有效量≥10
5 pfu/ml；或是该制剂混合其他对该弧菌有抑制作用的试剂使用。
11.其中，上述制剂中，辅料为sm缓冲液、无菌海水等一种或多种；所述sm缓冲液包括10 mm tris-hcl、100 mm nacl、10 mm mgso4，ph 7.8。
12.所述噬菌体的分离方法包括以下步骤：将0.22μm的海水与培养至对数期的弧菌混合，继续培养至7天，在第1、3、7天分别采用双层平板法进行噬菌体分离。挑选单个噬菌斑，并继续采用双层平板法对噬菌体进行了纯化，共纯化5次，后进行富集得到噬菌体悬浮液。然后经过渐次扩大培养、多次离心、peg 8000沉淀、氯化铯密度梯度离心净化、染色后，采用透射电子显微镜观察，鉴定此噬菌体为长尾噬菌体。
13.所述噬菌体（vb_vne-09sg01）在裂解新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）中的应用；具体能够应用到防治海产贝类应对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）的侵染中，或应用到水环境中对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）进行杀灭。
14.进一步的，所述噬菌体（vb_vne-09sg01）及其制剂对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）进行杀灭的终浓度为≥10
5 pfu/ml。
15.所述噬菌体能够用于致病弧菌的药物制备中，尤其是新喀里多尼亚弧菌引起的病症的药物制备中。
16.本发明的有益效果在于：（1）采用该噬菌体特异性杀灭能够导致贝类死亡和摄食量降低的新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus），同样也能够侵染其他2种新喀里多尼亚弧菌，具有有效的应用价值。
17.（2）该噬菌体分离自海水环境，效果持久稳定，个别辅助试剂也均属于无毒无害化学物，不会对养殖生物和环境产生影响，无毒无害，安全环保。
18.（3）该噬菌体对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）具有迅速且持久的杀灭效果，而且能够显著提高侵染后贝类的摄食量，因此可以作为药物应用于该弧菌引发
的贝类死亡等。
附图说明
19.图1 为实施例中噬菌体（vb_vne-09sg01）的噬斑示意图。
20.图2 为实施例中噬菌体（vb_vne-09sg01）的投射电镜照片。
21.图3为实施例中噬菌体（vb_vne-09sg01）的不同浓度杀菌效果图。
22.图4为实施例中噬菌体（vb_vne-09sg01）在不同ph条件下的存活情况趋势图。
23.图5为实施例中噬菌体（vb_vne-09sg01）在不同温度条件下的存活情况趋势图。
24.图6为实施例中噬菌体（vb_vne-09sg01）在不同盐度条件下的存活情况趋势图。
25.图7为实施例中弧菌侵染虾夷扇贝时不同处理的摄食量变化图。
具体实施方式
26.下面结合附图及实施例对该弧菌噬菌体及其应用做详细描述。
27.实施例1：1、噬菌体（vb_vne-09sg01）分离与纯化以发病扇贝为对象，采用tcbs培养基进行划线纯化，后采用菌株溶血平板挑选溶血性活性的疑似致病菌；经过16s测序鉴定，该致病与新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）相似性为100%。在12℃条件下，仅在海水中添加该弧菌，就能够导致虾夷扇贝的摄食率降低67%，海湾扇贝的摄食率降低34%，栉孔扇贝的摄食率降低44%，致死率介于5-20%不等。
28.将0.22μm的海水与培养至对数期的弧菌混合，继续培养至7天，在第1、3、7天分别采用双层平板法进行噬菌体分离。挑选单个噬菌斑，并继续采用双层平板法对噬菌体进行了纯化，共纯化5次，其双层平板照片如图1所示，在经过24h的侵染后，噬菌体在双层平板上形成0.20-0.50cm（平均大小为0.75
±
0.09 cm）的噬菌斑，噬菌斑由正中间的透明圈和边缘的模糊圈组成，边缘较整齐；随侵染时间增加，噬菌斑会缓慢增大，直至侵蚀整个平板。
29.取纯化后的噬菌体，渐次扩大培养，分别采用50ml、100ml和1l体积的培养基，中间采用分光光度计测定细菌od
600
值以判定是否裂解，培养条件为28-30℃，160 rmp；在获得大体积的病毒裂解时，采用多次离心方式（12000 rmp，5min）获得病毒上清；然后添加终浓度为10%（w/w）的peg 8000和终浓度为1%（w/w）的nacl，在4℃条件下沉淀≥12h后，通过低温高速离心（10000g，45min，4℃）获得沉淀；离心结束时去除上清，加入适当体积的sm缓冲液以及适量体积的氯仿，保存在4℃和-80℃条件下，即得噬菌体保存液。
30.噬菌体（vb_vne-09sg01）制剂的制备取上述获得的噬菌体，采用双层平板法检测其效价，应大于109pfu/ml，使用sm缓冲液进行稀释，制剂中噬菌体效价应≥10
6 pfu/ml。
31.在实际操作过程中，还可以向噬菌体浓缩中加入无菌海水、海水富集培养基的一种或多种，只要保证总含量≥10
6 pfu/ml，均可以实现本发明目的。
32.实施例2：噬菌体功能基因组提取测序在通过dnase降解宿主序列-蛋白酶k降解噬菌体衣壳蛋白-酚氯仿抽提后，获得噬菌体基因组。采用illumina高通量测序平台novaseq 6000进行测序。
33.测序结果经过ncbi和viptree比对，在数据库859个噬菌体基因组中，噬菌体vb_vne-09sg01基因组仅与噬菌体vibrio phage qdvp001相对相似性较高，但相似序列覆盖度仅为47%，与其他噬菌体基因组相似序列的覆盖度均在12%及以下，说明噬菌体vb_vne-09sg01的新型性很高。
34.采用genemark进行基因功能预测，获得244个基因，选取10个基因的预测结果见下表1，gene1-10的具体序列见序列表。
35.表1 功能基因组gene1-10的预测功能和相似度比对10的预测功能和相似度比对上表中，gene1所合成的归巢内切酶能够在病毒侵染时，降解宿主的基因组，以提供脱氧核苷酸用于噬菌体基因组的合成。gene 5和gene 8能够编码与噬菌体基座组装相关的蛋白，gene 7则编码与噬菌体尾部组装相关的蛋白，上述3个基因的编码蛋白均是噬菌体衣壳蛋白组装的一部分。表中其他基因组，例如gene2、gene3、gene4等，与ncbi数据库中功能不清楚的噬菌体序列同源（相似性介于67.14-98.45%），这些功能未知的基因组也侧面反映了该噬菌体具有很强的新型性。
36.实施例3：噬菌体特性实验1、噬菌体电镜查看新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）噬菌体自命名为vb_vne-09sg01，其电镜照片如图2所示，该噬菌体具有呈现多面体的头部和较长的尾部，属于长尾科噬菌体，尾部长141
±
5 nm，头部约为81
±
2 nm左右。
37.2、噬菌体vb_vne-09sg01的杀菌范围分析取从发病鲍、发病扇贝（虾夷扇贝、栉孔扇贝和海湾扇贝）、发病区海水中，采用
tcbs培养基分离、纯化菌株28株，分别制成菌苔后，在菌苔上滴加10 μl噬菌体溶液，以天然海水点样作为对照，培养1-7d，观察噬斑形成情况。结果如表2所示，噬菌体vb_vne-09sg01对包括分离宿主在内的3种新喀里多尼亚弧菌（2株分离自发病鲍体内、1株分离自扇贝体内）具有侵染性，表明噬菌体vb_vne-09sg01宿主范围相对较广，可以作为针对海洋贝类的广谱噬菌体制剂。
38.表2 噬菌体制剂vb_vne-09sg01的杀菌谱09sg01的杀菌谱注：+代表能够形成明显噬斑；-代表不能形成明显噬斑。
39.3、噬菌体制剂（vb_vne-09sg01）的实验室杀菌效果将不同浓度（10
4-10
9 pfu/ml）的噬菌体vb_vne-09sg01剂添加到处于对数培养期的新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）培养液中，病毒与细菌的数目比值分别为
10:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000，对照组（control）不添加病毒。每30min测定细菌浓度od
600
，结果表明在30 min，10:1添加组的裂解比例最高为32.68%，其他实验组的裂解比例为10.24-15.45%；至360min，所有实验组的细菌裂解量均达到89.51%以上；相比其他实验组，1:10000（病毒浓度为10
4 pfu/ml）的裂解效果显著低于其他处理组，具体见附图3所示，噬菌体制剂vb_vne-09sg01在10
5 pfu/ml就可以达到较好的杀菌效果。
40.4、噬菌体制剂（vb_vne-09sg01）的温度、盐度和ph稳定性为测定噬菌体的ph稳定性，将已知浓度的噬菌体液与不同ph值的培养基（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）按照1:9的体积比进行混合，混匀后，至于4℃条件下避光放置24h，然后通过双层平板法进行噬菌体的计数。结果表明（如图4、5、6所示），噬菌体（vb_vne-09sg01）在实验的ph范围内呈现倒钟形趋势，在ph 7和ph 7.5的条件下保存最佳，在ph 10时剩余46.4%的活性噬菌体。在实际养殖环境中，ph值基本上处于7-8之间，该噬菌体制剂可以维持很高的活性。
41.为测定噬菌体的温度稳定性，将已知浓度的噬菌体液在不同温度下（4-32℃）避光处理24h，然后通过双层平板法进行噬菌体的计数。结果表明，噬菌体浓度随温度升高显著降低。说明，噬菌体（vb_vne-09sg01）最好低温储存，但即使在32℃条件下处理24h后仍有54.4%的噬菌体存活。
42.为测定噬菌体的盐度稳定性，将已知浓度的噬菌体液与不同盐度值的培养基（0-33
‰
）按照1:19的体积比进行混合，混匀后，至于4℃条件下避光放置24h，然后通过双层平板法进行噬菌体的计数。结果表明，噬菌体制剂vb_vne-09sg01在盐度为29.7
‰
的条件下保存最佳，在盐度26.4和33.0
‰
条件下剩余活性噬菌体分别为87.4%和90.0%，即使在0
‰
的淡水条件下也有52.5%的噬菌体存活。说明噬菌体（vb_vne-09sg01）对盐度的耐受性较广，可应用于河口至海水等养殖环境。
43.实施例3：具体应用实验噬菌体制剂（vb_vne-09sg01）对在弧菌侵染虾夷扇贝的应用示例为探究噬菌体制剂vb_vne-09sg01的治疗效果，在实验室条件下，模拟新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）对虾夷扇贝的侵染。实验共设5个处理组，处理见下表3。其中，噬菌体（vb_vne-09sg01）的每次添加终浓度是10
6 pfu/ml，弧菌为10
6 cells/ml，抗生素（氟苯尼考，提前实验证明对喀里多尼亚弧菌致死）为0.01g/l。所选虾夷扇贝为3龄扇贝，壳高平均为74.66
ꢀ±ꢀ
4.94 mm，全湿重为51.92
ꢀ±ꢀ
10.92 g；实验温度为12℃；每组的养殖水体为4l；每天上午9:00左右全部更换养殖水，更换后添加噬菌体剂、抗生素或弧菌；下午进行摄食量的测定，投喂的微藻是海水小球藻液。
44.表 3 实施例噬菌体制剂vb_vne-09sg01应用实验的实验设置
在3d添加活性弧菌时，抗生素添加组和弧菌添加组的虾夷扇贝摄食量均显著降低，降低比例分别为43.20%、47.37%，而噬菌体（提前）添加组则与对照组基本持平。在3-12d，噬菌体添加组的摄食量与对照组基本一致，噬菌体提前添加组的摄食量略低于对照组，但明显高于其他处理组；抗生素添加组在3-7 d的摄食量高于弧菌直接添加组，在8-12d则低于弧菌直接添加组，结果如图7所示。
45.本次实验结果说明，在面对新喀里多尼亚弧菌的侵染时，虾夷扇贝的摄食量显著降低；噬菌体添加或提前添加均能够缓解或抵消弧菌侵染导致的伤害；抗生素添加只能够对略微缓解弧菌的侵染，效果远不如噬菌体（vb_vne-09sg01）。
46.以上仅为本发明的集中实施例，本发明获得的噬菌体（vb_vne-09sg01）还适用于其他新喀里多尼亚弧菌引发的贝类死亡治疗和预防，同时也可以作为免疫制剂长期在贝类养殖过程中使用。