一种鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白及其编码基因和应用

一种鸭
α
干扰素与鸭白介素2融合蛋白及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白及其编码基因和应用。


背景技术：

2.干扰素是一种具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生理活性的细胞因子。我国对重组人干扰素的研究已经取得重大进展，但是，由于禽类与人的干扰素同源性较低，用于人类干扰素的研究不适合禽类，所以禽类干扰素的研究相对滞后。近年来鸭养殖业一直在稳步增长，但由于养殖环境与技术相对落后，导致鸭病毒性传染病如鸭瘟、鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、鸭病毒性肝炎等威胁着鸭养殖业的发展。基因工程重组鸭干扰素作为一种广谱的抗病毒药物，在临床上应用广泛，对鸭病毒性肝炎、鸭瘟和黄病毒等病毒性疾病有较好的治疗效果。
3.白介素2(il-2)能促进t细胞和b淋巴细胞活化增殖并参与体液免疫和细胞免疫应答，是一种调控人体免疫系统稳态的极为重要的多功能细胞因子。研究表明鸭il-2在h9n2感染后发挥了调控细胞免疫和体液免疫的作用。同时，鸭il-2还可以作为免疫佐剂配合疫苗使用，可以提高疫苗的免疫效果，降低副反应，同时还具有免疫增强、免疫治疗等功能。
4.由于养殖环境与技术相对落后，目前的鸭病毒性传染病如鸭瘟、鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、鸭病毒性肝炎等严重威胁着鸭养殖业的发展，有研究表明将防御素与干扰素联合使用可实现细菌性疾病与病毒性疾病等主要流行疾病的预防与治疗。但α干扰素与其他细胞因子联合使用，需分别表达两种细胞因子进行联合用药，成本过高。现有技术中还未实现能稳定和高表达鸭α干扰素(duifn-α)与鸭白介素2(duil-2)融合蛋白的技术。因此，研究高表达量、高活性的鸭α干扰素与鸭白介素2的融合蛋白，对于预防和治疗鸭感染性疾病具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有基因工程技术制备鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白存在的上述问题，本发明提供一种鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白及其编码基因和应用，本发明提供的鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白具有较高的抗病毒和抑菌活性，在特定的表达系统中具有极高的表达量和稳定性，且对淋巴细胞的增殖具有促进作用。
6.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
7.一种鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白，具有如seqidno:1所示的氨基酸序列。其中，seqidno:1所示的氨基酸序列为通过ggggsggggsggggs蛋白序列将鸭α干扰素(duifn-α)与鸭白介素2(duil-2)两个功能不同的蛋白序列连接得到。
8.相对于现有技术，本发明提供的融合蛋白是通过三个重复的g4s将鸭α干扰素(duifn-α)与鸭白介素2(duil-2)两个功能不同的蛋白连接。该融合蛋白兼具鸭α干扰素与鸭白介素2的双重生物学活性，且该融合蛋白的抗病毒活性和抑菌活性较高。同时，该融合
蛋白在特定的表达系统中表达后还达到了显著的促淋巴细胞增殖活性。
9.本发明还提供了所述鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白在作为鸭抗病毒药物中的应用。
10.本发明还提供了所述鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白在作为鸭抑菌药物中的应用。
11.本发明还提供了编码所述鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白的融合基因，所述融合基因通过连接序列将鸭α干扰素与鸭白介素2的基因序列连接得到；所述融合基因的碱基序列如seqidno:2。
12.利用上述连接序列可实现鸭α干扰素与鸭白介素2的串联表达，在特定的表达系统中使融合蛋白形成包涵体形式，该包涵体形式的融合蛋白经变性后通过1步亲和层析即可实现融合蛋白的高度纯化，显著降低融合蛋白的生产和纯化成本。
13.本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含所述融合基因及其表达调控原件。
14.本发明还提供了所述重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
15.a、通过soe-pcr方法将duifn-α基因和duil-2基因连接，得到所述融合基因；
16.b、将所述融合基因与blunt载体连接，得到blunt-duifnα-il2重组质粒；
17.c、通过酶切连接的方法将所述blunt-duifnα-il2重组质粒中的所述融合基因连接到pet32a质粒中，得到pet32a-duifnα-il2重组表达载体。
18.将本发明中编码所述鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白的基因通过上述方式连接至pet32a质粒中，可以实现在大肠杆菌bl21中准确和高效表达，提升上述融合蛋白的表达量。
19.优选的，步骤a中，所述soe-pcr方法中，用于扩增duifn-α基因的上下游引物分别为seqidno:3和seqidno:4；用于扩增duil-2基因的上下游引物分别为seqidno:5和seqidno:6；其中，引物seqidno:4和引物seqidno:5分别包含部分连接序列，用于融合duifn-α基因和duil-2基因。
20.优选的，步骤c中，所述酶切连接的方法中所用的限制性内切酶为ecor i和hind iii。
21.本发明还提供了一种宿主细胞，包含所述重组表达载体并表达所述鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白的工程菌。
22.优选的，所述工程菌为大肠杆菌bl21。
23.工程菌选择bl21，更加利于形成正确的鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白空间构象，保证鸭α干扰素与鸭白介素2融合蛋白的高活性，使其无论是抗病毒活性还是抑菌活性，尤其对水泡性口炎病毒(vsv)的抗病毒活性，较其他表达系统都得到了提高。
附图说明
24.图1是本发明实施例中扩增duil-2基因和duifn-α基因的pcr产物的凝胶电泳图，m：2000maker，1：duil-2，2：duifn-α；
25.图2是本发明实施例中duifnα-il2融合基因的pcr扩增产物的凝胶电泳图，m：maker，1：duifnα-il2；
26.图3是本发明实施例中blunt-duifnα-il2重组质粒转化dh5α感受态后的菌体pcr扩增产物的凝胶电泳图，m：maker，1和4：阴性菌落，2和3：阳性菌落；
27.图4是本发明实施例中pet32a-duifnα-il2重组载体转化到bl21感受态后的菌体pcr扩增产物的凝胶电泳图，m：maker，1-3：阳性菌落；
28.图5是本发明实施例中融合蛋白的sds-page可溶性鉴定图，m：蛋白maker，1：pet32a质粒空载诱导前，2：pet32a质粒空载诱导后，3：菌诱导前，4：菌诱导后，5：超声破碎上清，6：超声破碎沉淀；
29.图6是本发明实施例中纯化后的融合蛋白的sds-page分析图，m：蛋白maker，1：纯化后的融合蛋白样品；
30.图7是本发明实施例中的pet32a-duifnα的质粒图谱；
31.图8是本发明实施例中的pet32a-duil2的质粒图谱。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.实施例
34.1实验材料
35.1.1菌株、质粒、病毒和细胞
36.材料中e.coli bl21和e.coli dh5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；
37.pet32a-duifnα质粒和pet32a-duil2质粒，由河北农业大学兽用生物制品试验室提供，pet32a-duifnα的质粒图谱如图7所示，pet32a-duil2的质粒图谱如图8所示；
38.vsv病毒和vero细胞，由河北农业大学兽用生物制品试验室提供。
39.1.2仪器、试剂和溶液
40.表1仪器
41.42.表2试剂
[0043][0044][0045]
表3溶液
[0046]
[0047][0048]
2实验方法、结果和分析
[0049]
2.1重组原核表达载体的构建
[0050]
2.1.1引物的设计与合成
[0051]
根据soe-pcr原理及鸭α干扰素(seqidno:7)与鸭白介素2(seqidno:8)的基因序列，设计用于扩增duifn-α、duil-2和pet32a-duifnα-il2基因的引物。得到的引物序列如表4所示，其中引物duifnα-f/duifnα-r用于扩增duifn-α基因；引物duil2-f/duil2-r用于扩增duil-2基因；引物duil2-f/duifnα-r用来融合duifn-α基因和duil-2基因。
[0052]
表4引物序列
[0053][0054]
duil2-f和duifnα-r含部分连接序列(linker序列)，linker序列编码的氨基酸序列为：“ggggsggggsggggs”，du-ifnα基因和du-il2基因之间加入通过上述linker序列连接，可以保证du-ifnα和du-il2之间不会影响彼此的三级结构，从而保证生物学活性不会受到影响。
[0055]
2.1.2重组表达载体pet32a-duifnα-il2的构建
[0056]
2.1.2.1重组质粒的提取
[0057]
分别将携带pet32a-duifn-α和pet32a-duil-2重组质粒的大肠杆菌活化培养后，涂布于lb/amp+平板上，倒置培养12h。挑取单克隆菌落，置于1.5ml离心管中500μl液体lba培养基中，37℃、200rpm培养5h。将活化后的菌液接种于液体lba培养基中，37℃、180rpm培养12h。按照biomiga质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒。
[0058]
2.1.2.2duifnα-il2融合基因的pcr扩增
[0059]
分别以提取的质粒pet32a-duifn-α和质粒pet32a-duil-2为模板，以duifnα-f/duifnα-r和duil2-f/duil2-r为引物扩增duifn-α和duil-2基因。pcr扩增体系和pcr反应程序如下：
[0060]
pcr扩增体系50μl：
[0061][0062]
pcr反应程序：98℃预变性3min；98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。
[0063]
pcr结束后产物(duifn-α和duil-2基因)经核酸电泳检测，电泳检测结果如图1所
示，对正确的目的条带(1：duil-2；2：duifn-α)使用biomiga琼脂糖凝胶dna/pcr产物小量回收试剂盒进行回收，得到duifn-α基因和duil-2基因。
[0064]
以pcr扩增后回收的duifn-α基因和duil-2基因片段为模板，以duil2-f/duifnα-r为引物，进行pcr。
[0065]
pcr扩增体系：
[0066][0067]
pcr反应程序：98℃预变性3min；98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环；72℃延伸10min。
[0068]
上述pcr反应10个循环后，添加duil2-f/duifnα-r各2.5μl，在与上述pcr反应程序相同的条件下再进行20个循环。
[0069]
pcr产物经核酸电泳检测，得到约1159bp的duifnα-il2融合基因片段，大小与预期相符，如图2所示，对目的条带进行回收，得到duifnα-il2融合基因(seqidno:2)。
[0070]
2.1.2.3blunt-duifnα-il2重组质粒的构建
[0071]
按照simple cloning kit试剂盒说明，将上述duifnα-il2融合基因片段和blunt空载以摩尔比7∶1进行混合成为5μl连接体系，于16℃连接12h，得到blunt-duifnα-il2。
[0072]
将blunt-duifnα-il2转化进入dh5α感受态中，具体操作如下：
[0073]
将dh5α感受态从-80℃冰箱中取出后，立即放入冰上，待其溶解。之后在超净台中，将5μl blunt-duifnα-il2重组体系加入到dh5α感受态中，冰浴30min，结束后放入42℃水浴锅中热激45s，立即取出在冰上冰浴2min，加入lb 500μl，37℃，200rpm摇床培养1h。菌液浑浊后，4000rpm离心4min，弃掉大部分上清，留100μl上清吹匀菌泥，滴在加氨苄青霉素的nb平板上用三角刮涂布均匀，37℃倒置培养12h，观察菌落生长情况。
[0074]
2.1.2.4blunt-duifnα-il2重组质粒的鉴定
[0075]
用2.1.2.3中的平板挑取单菌落到加有氨苄青霉素的lb培养基中进行摇床培养，菌液培养至浑浊后，以菌液为模板，进行菌体pcr鉴定。
[0076]
菌液pcr扩增体系：
[0077][0078]
pcr扩增体系中的引物序列如下：
[0079]
m13-f：gtaaaacgacggccagt(seqidno:9)；
[0080]
m13-r：caggaaacagctatgac(seqidno:10)。
[0081]
pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环；72℃延伸10min。
[0082]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示pcr产物经电泳可见2、3是阳性样品，具有约1259bp的片段，大小与预期相符，如图3所示。保存pcr产物为阳性的菌液，得到含有blunt-duifnα-il2重组质粒的dh5α菌。
[0083]
2.1.2.5duifnα-il2融合基因与pet32a空载的连接与转化
[0084]
从上述2.1.2.4中得到的菌液中按照biomiga质粒小量提取试剂盒说明书提取blunt-duifnα-il2重组质粒。将得到的blunt-duifnα-il2重组质粒和pet32a空载体用限制性核酸内切酶ecor i和hind iii分别进行双酶切。酶切反应体系如下：
[0085][0086]
双酶切结束后经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，使用biomiga琼脂糖凝胶dna/pcr产物小量回收试剂盒回收酶切得到的目的基因和pet32a空载体，进行连接，连接体系如下：
[0087][0088]
连接条件：16℃恒温水浴过夜，得到连有duifnα-il2融合基因片段的重组表达载
体pet32a-duifnα-il2。
[0089]
按照2.1.2.3中的方法将重组表达载体pet32a-duifnα-il2转化到dh5α感受态中。挑取单菌落摇菌后进行菌液pcr鉴定，鉴定体系和反应条件同2.1.2.3中的菌液pcr。经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，大小与预期相符，保存鉴定结果为阳性的菌液，得到含有pet32a-duifnα-il2的dh5α菌。
[0090]
按照biomiga质粒小量提取试剂盒说明书从含有pet32a-duifnα-il2的dh5α菌液中提取质粒。将得到pet32a-duifnα-il2质粒采用2.1.2.3中的方法转化至bl21感受态中，进行摇菌培养，摇菌培养时按1:1000在lb培养基中加入氨苄青霉素。得到菌液后采用与2.1.2.4中相同的反应体系进行菌液pcr鉴定。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，1-3号测定的菌液样品均为阳性，大小与预期相符，如图4所示，将检测结果为阳性的菌液为有pet32a-duifnα-il2的bl21重组菌，将其命名为bl21/pet32a-duifnα-il2。
[0091]
2.2融合蛋白rduifnα-il2的表达及纯化
[0092]
2.2.1融合蛋白rduifnα-il2的诱导表达
[0093]
将上述bl21/pet32a-duifnα-il2菌液按照1％的接种比例接种到10ml液体lb(含相应抗性)中，37℃、200rpm培养至od600值为0.6时，加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导4h，结束培养。
[0094]
2.2.2表达产物的可溶性分析
[0095]
将诱导表达培养结束后的菌液12000rpm离心10min。弃掉上清，将底部菌泥用pbs溶液重悬。之后将菌悬液置于冰上超声波破碎。破碎完成后，将菌液12000rpm离心15min，取上清和沉淀进行sds-page电泳，测定蛋白是可溶性表达或者以包涵体形式的不溶性表达。sds-page分析结果显示，诱导表达的融合蛋白rduifnα-il2(seqidno:1)以包涵体形式存在，如图5所示。
[0096]
2.2.3融合蛋白纯化
[0097]
将诱变后的菌泥用pbs溶液重悬，进行超声波破碎，离心后弃掉上清，在沉淀中按1g沉淀：40ml binding buffer的比例加入binding buffer进行变性，直至包涵体蛋白完全溶解，4℃、10000rpm离心15min收集上清，于-80℃保存备用。
[0098]
用his标签蛋白纯化试剂盒纯化上清中的蛋白，具体操作如下：
[0099]
将ni-agarose resin取3ml加入到10ml层析柱中，室温静置10min，待凝胶和液体分层后，打开出口，排除无水乙醇。填好柱子后，依次用ddh2o和binding buffer冲洗柱子各一遍。将包涵体变性液上清用0.45μm滤膜过滤，以去除不溶性的小颗粒。将过滤后的上清缓慢加入层析柱中，速度为15ml/h。此步重复2次，以便蛋白充分与层析柱结合。之后用22.5ml binding buffer冲洗蛋白纯化柱，除去杂蛋白。最后加入7.5ml elution buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱的蛋白液。此过程中所有要过柱子的溶液都要经过微孔滤膜过滤除杂后才能进入柱子。
[0100]
将纯化后收集的蛋白液经sds-page电泳分析，对其中的蛋白分子量及纯度进行鉴定。分析结果显示，纯化后的融合蛋白大小约48kda，融合蛋白条带单一，纯化效果良好，如图6所示。
[0101]
融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在，表达效果好、组成单一，可以保护重组蛋白免受蛋白酶的降解。经过变性后his标签充分暴露，达到较好的传化效果。
[0102]
2.2.4融合蛋白的复性
[0103]
用透析复性法对纯化后的蛋白进行复性。将截留目的蛋白大小的透析袋煮沸10分钟后，在4℃保存备用。将蛋白液填加到透析袋中，将透析袋密封完好后泡入复性液中，之后全程4℃条件下，每4h更换一次复性液，直至完成4次更换，最后过夜透析至pbs中。经0.22μm滤膜过滤除菌，分装保存至-20℃
[0104]
2.2.5融合蛋白的浓度的测定
[0105]
用nanodrop2000测定复性后的蛋白的浓度，测浓度仪器先用2μl pbs进行校准，然后加入2μl复性后的蛋白样品进行测量，测量的融合蛋白的浓度为1.67mg/ml。
[0106]
2.3融合蛋白的抗病毒活性测定
[0107]
2.3.1培养vero细胞
[0108]
将冻存的vero细胞复苏。在-196℃的液氮中取出冻存vero细胞，快速放入37℃水浴锅中进行快溶，整个过程要尽量快速溶解细胞内的冰晶，减少对细胞的损伤。复苏的细胞直接加入到vero细胞培养基中，12h细胞贴壁后，再换新鲜的培养基。细胞传代培养3代后，备用。
[0109]
2.3.2融合蛋白的抗病毒活性
[0110]
将培养的vero细胞，弃掉培养液。用1.5ml胰酶消化后，弃去消化液。加入培养液吹吸混匀后，在96孔板中进行贴壁培养。细胞培养至单层后弃掉培养液，将复性后的融合蛋白300μl加入到含900μl培养液的离心管中进行4倍倍比稀释，稀释到4-8，每个梯度8个复孔。每个梯度加100μl到96孔中板。于37℃、5％的co2的细胞培养箱中孵育12h，弃去培养液。将保存的vsv病毒溶液用dmem营养液稀释至10-4
，每孔加100μl。同时设计阳性对照(只用病毒处理)；阴性对照(共稀释64倍的蛋白处理)和正常细胞对照(不做处理)。按照reed-muench法计算重组蛋白的抗病毒活性。
[0111]
将vsv在vero细胞上扩繁后测定，参考reed-muench法计算vsv在vero细胞上的tcid50，经计算vsv的病毒滴度为10
6.8
tcid50/ml。
[0112]
用微量细胞病变抑制法测定rduifnα-il2融合蛋白抗vsv活性，按照reed-mu法进行计算，结果如表5，通过计算得融合蛋白抗病毒活性为4-5.1
/0.1ml＝11763u/ml，融合蛋白浓度为1.67mg/ml，比活性为7.04
×
104u/mg。
[0113]
表5 rduifnα-il2融合蛋白的抗病毒活性
[0114]
[0115][0116]
2.4融合蛋白促淋巴细胞增殖活性测定
[0117]
2.4.1鸭外周血淋巴细胞(pblc)的制备
[0118]
按照动物淋巴细胞分离试剂盒操作要求，取spf鸭翅下静脉抗凝全血(肝素管)，加入等体积的全血稀释液稀释全血。在离心管中加入分离液(当稀释后血液总体积小于3ml时，加入3ml分离液；大于等于3ml时，加入等体积分离液)，将稀释后的血液平铺到分离液的液面上方，保持两液面分界清晰。在室温条件，水平转子500r/min，离心30min。离心后分为三层：最上层为稀释的血浆层，中间为透明的分离液层，底层为红细胞与粒细胞。在最上层与中间层中间的白膜层即为淋巴细胞。小心吸取白膜层细胞至15ml离心管中，使用10ml细胞洗涤液洗涤，250r/min离心10min。重复洗涤2次。离心后取上清，使用含2％胎牛血清的1640培养基重悬备用。
[0119]
2.4.1融合蛋白的促pblc活性
[0120]
将制备完成的pblc细胞数调整到每毫升约含细胞数1万个，将pblc加入到96孔细胞培养板培养。使用含有2％胎牛血清的1640完全培养基将rduifn-α蛋白、rduil-2蛋白和rduifnα-il2融合蛋白进行2倍倍比稀释，稀释比例为1∶21至1∶28，每个稀释度均重复3个孔，每孔加入pblc细胞液100μl，同时设立pblc细胞对照组和pbs对照组，放置于5％的co2、37℃培养箱培养72h。培养结束后，使用mtt法，经酶联免疫检测仪在570nm波长下测od值。取每个稀释度所有od
570
平均值代表该组的数值，通过ibm spss statistics 26软件进行统计学分析，以p《0.05为差异显著性判断标准。
[0121]
表6不同稀释比例融合蛋白对pblc的增殖效果(od570)
[0122][0123]
表6中，同一列不同小写字母表示在p＜0.05水平上达到显著性差异水平，不同大写字母表示在p＜0.01水平上达到极显著差异水平。
[0124]
通过表5和表6中的检测结果可知，rduifnα-il2融合蛋白具有抗病毒和促淋巴细胞增殖的双重活性，且其抗病毒活性和促淋巴细胞增殖活性均较高。
[0125]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。