与棉花纤维伸长率品质性状关联的SNP分子标记及应用

与棉花纤维伸长率品质性状关联的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及与棉花纤维伸长率品质性状关联的snp分子标记及应用，属于分子生物学，生物信息学领域。


背景技术：

2.棉纤维是由受精胚珠的表皮细胞经伸长、加厚而成的种子纤维，是一种优良的天然纤维，也是纺织工业的主导原料，在世界及我国国民经济中占有重要地位。纤维品质是多基因控制的复杂数量性状，组成因子包括：纤维长度、强度、细度、伸长率、整齐度、成熟度等。棉纤维品质的表型值除了受品种的遗传因素控制外，还受多种环境因素以及品种与环境交互作用的综合影响。棉花纤维伸长率也是纤维品质中的重要指标之一，棉纤维的断裂伸长率是指纤维拉伸至断裂时的伸长与原长的比值的百分率。棉纤维的伸长率越大，表示棉纤维的变形能力越好、刚性越差。棉纤维伸长率的表型变异主要来源于品种效应、环境效应以及品种与环境的互作效应。多个研究已经证明，纤维伸长率与纤维长度和强度存在显著的相关关系，因此深入研究纤维伸长率对理解棉纤维长度和强度形成的机制具有重要的参考意义。
3.传统的育种方法改良纤维品质，首先要用具有高纤维强度基因种质材料与现有陆地棉品种进行一系列杂交和回交，以打破纤维品质性状与产量性状之间的负相关，但是在每轮回交中都要对纤维品质进行检测，成本很高，工作量很大，而且只能等到收花结束一段时间后才能知道结果，另外，环境对纤维品质也有影响。这就要求必须有较大的育种群体，因此会造成盲目性加大、费时费力、成本加高，导致品质育种进展缓慢，因此早期通过标记辅助鉴定出高、低强度纤维种质材料，能大大节省育种改良的工作。
4.snp(单核苷酸多态性)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。snp作为一种重要的遗传学工具，具有分布广泛、数量众多、易于批量检测等优点，同时也是功能基因组学研究的重点对象。snp适于复杂性状的遗传分析，引起群体差异的基因识别等方面的研究，对于植物高密度遗传图谱的构建、新基因的克隆及功能研究等具有十分重要的作用。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供与棉花纤维伸长率品质性状关联的snp分子标记及应用。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
7.与棉花纤维伸长率品质性状关联的snp分子标记，所述snp分子标记为seq id no.1-seq id no.39所示核苷酸序列中至少一个。
8.所述snp分子标记为seq id no.1-seq id no.39所示核苷酸序列中两个及两个以上的组合。
9.所述snp分子位点于序列第51bp处发生突变，所述snp分子标记的突变形式如下所
示：
10.[0011][0012]
一种所述snp分子标记在鉴定棉花纤维伸长率品质性状中的应用。
[0013]
一种所述snp分子标记在棉花辅助育种中的应用。
[0014]
一种所述snp分子标记在棉花种质资源改良中的应用。
[0015]
一种检测所述snp分子标记的引物或试剂。
[0016]
一种检测权所述snp分子标记的试剂盒。
[0017]
一种利用所述snp分子标记分析棉花纤维伸长率的方法，包括以下步骤：
[0018]
(1)提取待测样品的基因组dna；
[0019]
(2)以提取的dna为模板，根据snp分子标记设计引物，分别进行pcr扩增；
[0020]
(3)根据pcr扩增产物，分析棉花纤维伸长率。
[0021]
本发明的有益效果：
[0022]
本发明提供的snp分子标记，是使用迄今为止，棉花中最大的群体检测出来的snp。相对其他群体，有更准确和新的信号位点。可以用于棉花纤维伸长率早期更为准确全面的预测和筛选。其以dna形式体现，不受取样部位、环境等因素影响，可以直接以是否有该标记分析。
具体实施方式
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以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
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实施例1、snp分子标记的获得
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(1)纤维伸长率的测定
[0026]
群体于2017、2018年进行5点2重复(部分地点为1重复)试验。1799个子代和13个亲本共计1812份材料在亚群体内及亚群体间进行随机排列。亚群体内随机加入该亚群体的双亲。群体整体设置3个对照，分别为该群体的亲本zzm3、鲁棉研28、锦科178。3个对照在群体中每隔15个材料依次出现，并最终均匀覆盖到整个群体中。5个试验点分别是：河南安阳(ay)、安徽安庆(aq)、河北邢台(xt)、新疆石河子(shz)、新疆阿拉尔(ale)。每个试验点均按单行区(除新疆阿拉尔为双行)、2m行长种植，每行株数在10-30株之间(具体依照当地栽培模式)，取样时间为9月20日至10月20日不等(具体依照当地霜期及栽培模式)，除两端2株外，每小区取其余株中部靠主茎铃，每株取1-2个铃不等，共取20铃。为减少错误，采用本发明的唯一条形码编号系统，号牌放入铃重袋中，为减小误差，所有各地铃重材料均在中国农业科学院棉花研究所河南安阳农场采用新乡mpsy-20a皮辑轧花机对收获的20铃样品进行
轧花并获取皮棉样品，利用农业农村部棉花纤维品质监督检验中心(安阳)的hft9000(hvicc校准水平)仪器按照说明书要求进行棉花纤维伸长率的测定。利用r软件包lme4(https://github.com/lme4/lme4)估计最佳线性无偏预测值(2年两次重复)。
[0027]
(2)提取待测样品的基因组dna
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①
取3g左右新鲜的叶片于带钢珠的2ml离心管中，液氮速冻，磨样机研磨成粉末。并加入800μl已预热(65℃)的ctab裂解液(使用前加入0.8％的β
–
巯基乙醇，65℃水浴锅中预热30min)，剧烈震荡后置于65℃水浴30-40min，每间隔10min上下晃动一次；水浴后冷却至室温。
[0029]
②
加入800μl的体积比24:1的氯仿：异戊醇混合液，缓慢上下颠倒，至混匀不分层为止。
[0030]
③
12000rpm离心10min。
[0031]
④
用无尖的枪头吸取上清液应转移至另一个1.5ml离心管中。
[0032]
⑤
加入1倍体积的无水乙醇，缓慢颠倒几次，直至出现絮状dna生成，静止10min。
[0033]
⑥
用小枪头挑出dna至1.5ml离心管中(或者12000rpm离心1.5min，去上清)，加入70％(v/v)乙醇洗1次。
[0034]
⑦
过夜干燥，加ddh2o，溶解dna，直至完全溶解，-20℃保存待用。
[0035]
(3)snp的检测
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共采集陆地棉样本1812份提取基因组dna后进行基因组重测序，其中亲本13份，重组自交系ril(recombinant inbred lines)1799份。采集样品时，将各品系的种子播种在培养箱中，采集棉株幼叶。用上述ctab法提取所有样本高质量的棉花基因组dna各5μg。提取的基因组dna送到深圳华大基因科技有限公司，用于基因组重测序。测序获得高质量的clean data，数据量为20.47gb，亲本平均测序深度35x，子代平均测序深度4x以上。以优质四倍体棉(g.hirsutum
‘
texas marker 1’)基因组为参考基因组进行序列定位。在映射之前，将所有未组装的contigs连接到一个伪染色体(命名为“chrun”)。使用bwa(v.0.7.12)软件分别将1812份样本的短序列映射到参考基因组，剔除所有未对齐的读段和低质量(映射质量小于20)的读段。然后，采用gatk unifiedgenotyper(v.3.8.0)分别对每个样本进行变异鉴定，并将所有样本(n＝1812)的变异文件合并为一个总的vcf文件。最后，分别鉴定出11,856,129个和4,543,742个高品质snp和indel。基于次等位基因频率大于0.05和缺失率小于0.2，使用vcftools进一步过滤变异位点筛选出高质量的snp和indel分别1,855,955个和l,309,084个，用作后续的全基因组关联分析。所有变异的影响由annovar进行注解。
[0037]
(4)陆地棉纤维伸长率性状的全基因组关联分析
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分别对步骤(1)所得的陆地棉性状结果和步骤(3)所得的基因型数据，采用(efficient mixed-model association expedited)(emmax)统计分析软件的混合线性模型进行统计分析，具体可参考：http://csg.sph.umich.edu/kang/emmax/download/index.html。统计模型为：
[0039]
y＝xα+zβ+wμ+e
[0040]
y为表型性状，x为固定效应的指示矩阵，α为固定效应的估计参数；z为snp的指示矩阵，β为snp的效应，w为随机效应的指示矩阵，μ为预测的随机个体，e是随机残差，服从e～(0，δ
e2
)。该模型中，通过在μ中加入亲缘关系矩阵来校正群体分析。分析发现共计有39个
snps同时与陆地棉纤维伸长率显著相关，snp标记的等位基因位点信息如表1所示，参考序列为陆地棉栽培品种tm-1，参考基因组版本号g.hirsutum_tm-1_icr
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(http://grand.cricaas.com.cn/page/download/download)。这些snp位点上下游50bp的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.39所示。
[0042]
表1与陆地棉纤维伸长率关联的snp分子标记
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[0044][0045]
(5)验证：利用1812份棉花多亲本群体2年5点共计10个环境下的纤维伸长率blup值(最佳线性无偏预测值)对上述snp的效应进行了验证，结果显示100％的snp表现出对陆地棉纤维伸长率性状变异具有显著的影响。