乙嘧酚半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用

1.本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及乙嘧酚半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用。


背景技术：

2.乙嘧酚英文名称为prometryn，化学名称为：5-丁基-2-乙基氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶，cas登记号为：23947-60-6，分子式为：c
11h19
n3o，分子量为：209.3，中文别名为：乙嘧醇、不霉定、乙氨哒酮、胺嘧啶、5-丁基-2-乙氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶、乙菌定或乙嘧酚。
3.乙嘧酚对草莓、西瓜、黄瓜、葡萄等许多作物白粉病的实际防效、对作物的安全性高于其他进口或国产同类产品。但不合理的乙嘧酚施药方式与施药剂量会造成环境污染与农药残留问题，残留的乙嘧酚可以通过富集作用在食物链中不断传递、迁移，从而对农产品的质量与安全、生态环境造成不良的影响，进而危害人类健康。因此，需对乙嘧酚的残留水平进行监测。
4.目前已经建立了许多检测环境样品、食品和农产品中乙嘧酚残留的方法。仪器分析方法具有足够的准确性和高度的敏感性，如液相色谱法(lc)、lc-串联质谱法(lc-ms/ms)、气相色谱法(gc)和gc-串联质谱法(gc-ms/ms)均是常用的检测方法。然而，这些仪器分析方法通常需要训练有素的人员、昂贵的仪器、复杂的样品预处理和耗时的分析过程，不适合用于现场对乙嘧酚的残留检测。
5.免疫分析方法由于其对抗原和抗体的特异性识别作用，具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且能大幅度降低检测成本。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种乙嘧酚半抗原、完全抗原、抗体制备方法及应用，本发明提供的乙嘧酚半抗原偶联后能够充分突出乙嘧酚抗原决定簇，制备得到的乙嘧酚完全抗原具有免疫原性，可特异性识别乙嘧酚，从而得到的抗乙嘧酚抗体特异性好，灵敏度高，进而可以用于乙嘧酚的免疫分析方法的研发。
7.本发明提供了一种乙嘧酚半抗原，具有式i所示结构：
[0008][0009]
所述式i中的r1为能够与载体蛋白直接偶联的活性基团。
[0010]
优选的，所述r1包括-(ch2)
n-cooh、-(ch2)
n-nh2、-(ch2)
n-oh、-(ch2)
n-coor2、
n为0～3的整数，m为0～4的整数，所述-(ch2)
n-coor2中的r2包括
[0011]
优选的，所述乙嘧酚半抗原具有式i-1或式i-2所示结构：
[0012][0013]
本发明提供了上述技术方案所述的乙嘧酚半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
将式ii所示结构的化合物结构中的r3基团通过化学反应替换为r1基团，得到所述式i所示结构的乙嘧酚半抗原；
[0015][0016]
所述式ii中的r3为-ch3或-coo-ch
2-ch3。
[0017]
优选的，所述式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原的制备方法包括以下步骤：
[0018]
将式5所示结构的化合物、无机强碱溶解于有机溶剂和水的混合溶液中进行水解反应，得到式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原；
[0019][0020]
本发明提供一种乙嘧酚完全抗原，由上述技术方案所述乙嘧酚半抗原或上述技术方案所述的制备方法制备得到的乙嘧酚半抗原与载体蛋白偶联得到。
[0021]
本发明提供了一种乙嘧酚抗体，将上述技术方案所述乙嘧酚完全抗原乳化后免疫宿主动物得到。
[0022]
本发明提供了上述技术方案所述乙嘧酚抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0023]
将上述技术方案所述乙嘧酚完全抗原乳化后免疫宿主动物；
[0024]
乙嘧酚多克隆抗体的制备方法为：将免疫宿主动物加强免疫后，采集免疫动物血液后分离，得到所述乙嘧酚多克隆抗体；
[0025]
乙嘧酚单克隆抗体的制备方法为：提取免疫的宿主动物的脾细胞，将所述脾细胞与sp2/0瘤细胞融合，筛选能够分泌乙嘧酚抗体的单克隆杂交瘤细胞株，基于所述单克隆杂交瘤细胞株制备所述乙嘧酚单克隆抗体；
[0026]
乙嘧酚纳米抗体的制备方法为：提取免疫的宿主动物血液中的b淋巴细胞转录的mrna，反转录为cdna，以所述cdna为底物pcr扩增获取多样化纳米抗体基因片段，将所述多样化纳米抗体基因片段构建噬菌体或酵母抗体表达库，经筛选得到乙嘧酚纳米抗体。
[0027]
本发明提供一种检测乙嘧酚的试剂或试剂盒，含有上述技术方案所述乙嘧酚抗体或者上述技术方案所述制备方法制备得到的乙嘧酚抗体。
[0028]
本发明提供上述技术方案所述乙嘧酚抗体或者上述技术方案所述制备方法制备得到的乙嘧酚抗体或者上述技术方案所述的试剂或试剂盒在检测乙嘧酚中的应用。
[0029]
本发明提供一种乙嘧酚半抗原，具有式i所示结构：
[0030][0031]
所述式i中的r1为能够与载体蛋白直接偶联的活性基团。
[0032]
本发明提供的乙嘧酚半抗原在保留乙嘧酚基本结构的基础上，以乙嘧酚原有的-ch
2-ch
2-ch
2-ch
2-结构作为连接臂的全部或部分连接结构，在-ch
2-ch
2-ch
2-ch
2-结构上远离乙嘧酚的特征结构的位点上引入能够与载体蛋白直接偶联的活性基团r1，不仅有效避免外接连接臂带来的非特异性结合，而且引入的活性基团偶联载体蛋白后能够充分暴露乙嘧酚本体分子的特征结构，制备得到的乙嘧酚完全抗原具有免疫原性，将乙嘧酚完全抗原免疫宿主动物后，制备的抗乙嘧酚血清或抗乙嘧酚抗体可以用于建立乙嘧酚免疫学检测方法或检测试剂，具有广阔应用前景。
[0033]
本发明提供一种乙嘧酚完全抗原，由上述技术方案所述乙嘧酚半抗原或上述技术方案所述的制备方法制备得到的乙嘧酚半抗原与载体蛋白偶联得到。本发明提供的乙嘧酚完全抗原进行免疫得到的抗乙嘧酚血清或抗乙嘧酚抗体，能够高效识别并特异性结合乙嘧酚，能够为乙嘧酚的免疫应用提供技术基础。
[0034]
本发明提供一种乙嘧酚抗体，将上述技术方案所述乙嘧酚完全抗原乳化后免疫宿主动物得到。本发明提供的乙嘧酚完全抗原进行免疫得到的抗乙嘧酚血清或抗乙嘧酚抗体，能够高效识别并特异性结合乙嘧酚。
[0035]
综上，本发明首次设计并合成乙嘧酚半抗原，由乙嘧酚半抗原偶联载体蛋白制备的乙嘧酚完全抗原具有免疫原性。本发明将乙嘧酚完全抗原免疫宿主动物后，制备得到具有高灵敏度和特异性的抗乙嘧酚抗体，可为建立抗乙嘧酚抗体的免疫分析方法提供技术基础。而且，基于本发明制备的抗乙嘧酚抗体研发的免疫分析方法，可满足现场快速检测乙嘧酚的需求，具有广阔应用前景。
附图说明
[0036]
图1为实施例1中的式i-1所示乙嘧酚半抗原的合成路线；
[0037]
图2为实施例2中的式i-2所示乙嘧酚半抗原的合成路线；
[0038]
图3为本发明中式iii所示乙嘧酚完全抗原的合成路径；
[0039]
图4为实施例1中式i-1所示乙嘧酚半抗原的液相色谱图；
[0040]
图5为实施例1中式i-1所示乙嘧酚半抗原的lcms的质谱图；
[0041]
图6为实施例1中式i-1所示乙嘧酚半抗原的1h nmr谱图；
[0042]
图7为实施例3中ova标准品的maldi-tof-ms谱图；
[0043]
图8为实施例3中的式iii-1所示乙嘧酚完全抗原的madli-tof-ms谱图；
[0044]
图9为实施例4中的bsa标准品的madli-tof-ms谱图；
[0045]
图10为实施例4中式iii-2所示乙嘧酚完全抗原的maldi-tof-ms谱图。
具体实施方式
[0046]
本发明提供了一种乙嘧酚半抗原，具有式i所示结构：
[0047][0048]
所述式i中的r1为能够与载体蛋白直接偶联的活性基团。
[0049]
在本发明中，所述r1优选包括-(ch2)
n-cooh、-(ch2)
n-nh2、-(ch2)
n-oh、-(ch2)
n-coor2、
n为0～3的整数，m为0～4的整数，所述-(ch2)
n-coor2中的r2包括
[0050]
在本发明中，所述n优选为0～3的整数，更优选为0。
[0051]
在本发明中，所述r1具体优选为-oh、-nh2、-cooh或-coor2。
[0052]
在本发明中，所述-(ch2)
n-coor2中的r2具体优选为
[0053]
在本发明的具体实施例中，所述乙嘧酚半抗原具体优选具有式i-1或式i-2所示结构：
[0054][0055]
本发明提供了上述技术方案所述的乙嘧酚半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0056]
将式ii所示结构的化合物结构中的r3基团通过化学反应替换为r1基团，得到所述式i所示乙嘧酚半抗原；
[0057][0058]
所述式ii中的r3为-ch3或-coo-ch
2-ch3。
[0059]
在本发明中，所述式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原的制备方法优选包括以下步骤：
[0060]
将式5所示结构的化合物、无机强碱溶解于有机溶剂(以下称为第一有机溶剂)和水的混合溶液中进行水解反应，得到式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原；
[0061][0062]
在本发明中，所述式5所示结构的化合物的制备方法优选包括以下步骤：
[0063]
在保护气体气氛中，将式1所示结构的化合物、式2所示结构的化合物和氢化钠(nah)溶解于有机溶剂(以下称为第二有机溶剂)中进行烷基化反应，得到式3所示结构的化合物；
[0064][0065]
将所述式3所示结构的化合物、式4所示结构的化合物、甲醇钠(ch3ona)、溶解于有机溶剂(以下称为第三有机溶剂)中进行缩合反应，得到式5所示结构的化合物；
[0066][0067]
在本发明的具体实施例中，式4所示结构的化合物具体为乙基硫酸胍。
[0068]
本发明在保护气体气氛中，将式1所示结构的化合物、式2所示结构的化合物和氢化钠(nah)溶解于四氢呋喃(thf)中进行烷基化反应，得到式3所示化合物。
[0069]
在本发明中，式1所示结构的化合物和式2所示结构的化合物的摩尔比优选为3:2。
[0070]
在本发明中，式1所示结构的化合物和nah的摩尔比优选为1:1。
[0071]
在本发明中，所述第二极性有机溶剂具体优选为四氢呋喃(thf)。
[0072]
本发明对所述thf的用量没有特殊要求，将式1所示结构的化合物、式2所示结构的化合物和nah完全溶解即可。
[0073]
在本发明中，所述烷基化反应优选在加热回流的条件下进行。
[0074]
在本发明中，所述烷基化反应的时间优选为12h。
[0075]
在本发明中，所述保护气体气氛优选为氮气气氛。
[0076]
在本发明中，所述烷基化反应后得到烷基化反应液，本发明优选对所述烷基化反应液进行后处理，得到式3所示结构的化合物。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行加入饱和氯化铵水溶液、加入水、采用乙酸乙酯萃取，合并有机相后采用饱和nacl水溶液洗涤有机相、干燥、浓缩和柱层析分离纯化。在本发明中，所述饱和氯化铵水溶液与所述thf的体积之比优选为1:3；所述水和所述饱和氯化铵水溶液的体积之比优选为5:1；所述乙酸乙酯萃取的次数优选为2洗，每次萃取使用的乙酸乙酯的体积与所述水的体积之比优选为1:1；所述干燥优选为采用无水硫酸钠进行；本发明对所述浓缩的具体实施过程没有特殊要
求；在本发明中，所述柱层析优选为硅胶柱层析，所述柱层析使用的洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积之比优选为10:1。
[0077]
在本发明中，所述式3所示结构的化合物为浅黄色油状物。
[0078]
得到式3所示化合物后，本发明将所述式3所示结构的化合物、式4所示结构的化合物(乙基硫酸胍)、甲醇钠溶解于第三有机溶剂中进行缩合反应，得到式5所示结构的化合物。
[0079]
在本发明中，所述式3所示化合物和式4所示化合物的摩尔比优选为2:1。
[0080]
在本发明中，所述式3所示化合物和甲醇钠的摩尔比优选为1:1。
[0081]
在本发明中，所述第三有机溶剂具体优选为甲醇。
[0082]
本发明对所述甲醇的用量没有特殊要求，将式3所示化合物、式4所示化合物和甲醇钠完全溶解即可。
[0083]
在本发明中，所述缩合反应的温度优选为70℃。
[0084]
在本发明中，所述缩合反应的时间优选为1h。
[0085]
在本发明中，所述缩合反应后得到缩合反应液，本发明优选对所述缩合反应液进行后处理，得到式5所示结构的化合物。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行去除乙醇溶剂、加入饱和氯化铵水溶液、采用乙酸乙酯萃取、有机相水洗、饱和nacl溶液洗涤、洗涤后的有机相干燥、浓缩和柱层析分离纯化。在本发明中，所述饱和氯化铵水溶液和乙醇的体积之比优选为4:3；所述乙酸乙酯和所述饱和氯化铵水溶液的体积之比优选为1:2；本发明优选采用无水硫酸钠干燥洗涤后的有机相；本发明对所述浓缩的具体实施过程没有特殊要求；在本发明中，所述柱层析优选为硅胶柱层析，所述柱层析使用的洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇，所述二氯甲烷和甲醇的体积之比优选为50:1。
[0086]
在本发明中，所述无机强碱优选为naoh。
[0087]
在本发明中，所述第一有机溶剂具体优选为乙醇。
[0088]
在本发明中，所述式5所示结构的化合物和所述无机强碱的质量比优选为11.56:8。
[0089]
在本发明中，所述乙醇和水的体积比优选为1:1。
[0090]
在本发明中，所述水解反应的温度优选为室温。
[0091]
在本发明中，所述水解反应的时间优选为16h。
[0092]
在本发明中，所述水解反应后得到水解反应液，本发明优选对所述水解反应液进行后处理，得到式i-1所述结构的乙嘧酚半抗原。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行：浓缩、用醋酸调节浓缩液ph值至4析出固体、固液分离、收集固体产物水洗、甲醇打浆和干燥。本发明对所述浓缩的具体实施过程没有特殊要求；所述水洗用水的体积与所述甲醇打浆中用甲醇的体积之比优选为1:2；本发明对所述干燥的具体实施过程没有特殊要求。
[0093]
在本发明中，所述式i-2所示结构的乙嘧酚半抗原的制备方法优选包括以下步骤：
[0094]
将式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中进行取代反应，得到式i-2所示结构的乙嘧酚半抗原。
[0095]
在本发明中，所述式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原和nhs的摩尔比优选为0.021:0.042。
[0096]
本发明中，所述式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原和edc的摩尔比优选为0.021:0.042。
[0097]
本发明中，所述式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原、nhs、edc溶解于dmf形成的反应液中，所述式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原的摩尔浓度优选为0.042mol/l。
[0098]
在本发明中，所述取代反应的温度优选为4℃。
[0099]
在本发明中，所述取代反应的保温时间优选为10h。
[0100]
在本发明中，所述取代反应优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌优选为磁力搅拌。
[0101]
本发明提供一种乙嘧酚完全抗原，由上述技术方案所述乙嘧酚半抗原或上述技术方案所述的制备方法制备得到的乙嘧酚半抗原与载体蛋白偶联得到。
[0102]
在本发明中，所述载体蛋白优选包括牛血清白蛋白(bsa)、卵清白蛋白(ova)或钥孔血蓝蛋白(klh)。
[0103]
在本发明中，所述乙嘧酚完全抗原的结构式优选如式iii所示：
[0104][0105]
在本发明中的具体实施例中，所述乙嘧酚完全抗原的结构式具体优选如式iii-1或式iii-2所示：
[0106][0107]
本发明提供了上述技术方案所述乙嘧酚完全抗原的制备方法，优选包括以下步骤：
[0108]
将乙嘧酚半抗原与载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到乙嘧酚完全抗原。
[0109]
在本发明中，所述乙嘧酚半抗原优选为式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原时，本发明优选将i-1所示结构的乙嘧酚半抗原按照上述式i-2所示乙嘧酚半抗原的制备方法制备得到式i-2所示乙嘧酚半抗原后再进行与载体蛋白的偶联反应。
[0110]
在本发明中，所述乙嘧酚半抗原优选以乙嘧酚半抗原的有机溶液的形式与所述载体蛋白进行偶联反应。
[0111]
在本发明的具体实施例中，所述乙嘧酚半抗原优选以上述技术方案所述的式i-2所示乙嘧酚半抗原的制备方法制备得到的取代反应上清液作为原料与所述载体蛋白进行偶联反应。
[0112]
在本发明中，在所述偶联反应的反应体系中，所述乙嘧酚半抗原与所述载体蛋白的摩尔比优选为(10～60):1，更优选为60:1。
[0113]
在本发明中，所述偶联反应的反应温度优选为0～50℃，更优选为4℃；所述偶联反应的时间优选为8～36h，更优选为12h；所述偶联反应的反应ph值优选为5～9，更优选为7.4。
[0114]
在本发明中，所述载体蛋白的缓冲溶液优选为载体蛋白的碳酸盐缓冲液(cbs)、磷酸盐缓冲液(pbs)、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的至少一种。在本发明中，述载体蛋白的缓冲溶液的ph值优选为5～9，更优选为7.4。
[0115]
在本发明中，所述偶联反应后，本发明优选还包括对所述偶联反应的反应体系进行透析，进行透析时所用的透析液优选为pbs溶液；所述pbs溶液的ph优选为7～10，更优选为7.4；所述pbs溶液的浓度优选为0.01～0.2mol/l，更优选为0.01mol/l。
[0116]
本发明的乙嘧酚半抗原稳定性好，合成的步骤少，合成成本低，反应条件简单，合成的半抗原纯度高，溶解性和稳定性能够满足偶联载体蛋白的要求。
[0117]
本发明还提供了上述方案所述的半抗原或者所述的乙嘧酚完全抗原在制备乙嘧酚抗体中的应用。
[0118]
在本发明中，所述乙嘧酚抗体优选为抗乙嘧酚的血清。
[0119]
本发明提供了一种乙嘧酚抗体，将上述技术方案所述乙嘧酚完全抗原乳化后免疫宿主动物得到。
[0120]
本发明提供了上述技术方案所述乙嘧酚抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0121]
将上述技术方案所述乙嘧酚完全抗原乳化后免疫宿主动物；
[0122]
乙嘧酚多克隆抗体的制备方法为：将免疫宿主动物加强免疫后，采集免疫动物血液后分离，得到所述乙嘧酚多克隆抗体；
[0123]
乙嘧酚单克隆抗体的制备方法为：提取免疫的宿主动物的脾细胞，将所述脾细胞与sp2/0瘤细胞融合，筛选能够分泌乙嘧酚抗体的单克隆杂交瘤细胞株，基于所述单克隆杂交瘤细胞株制备所述乙嘧酚单克隆抗体；
[0124]
乙嘧酚纳米抗体的制备方法为：提取免疫的宿主动物血液中的b淋巴细胞转录的mrna，反转录为cdna，以所述cdna为底物pcr扩增获取多样化纳米抗体基因片段，将所述多样化纳米抗体基因片段构建噬菌体或酵母抗体表达库，经筛选得到乙嘧酚纳米抗体。
[0125]
在本发明中，在制备乙嘧酚纳米抗体时，所述宿主动物优选为骆驼科或软骨鱼类。
[0126]
在本发明中，单克隆杂交瘤细胞株对本领域技术人员来说是容易制备的，例如取经上述完全抗原免疫宿主动物后获得脾细胞，在体外将其与sp2/0瘤细胞进行融合，通过选择性培养基筛选能够分泌抗乙嘧酚的单克隆杂交瘤细胞，即可得到单克隆杂交瘤细胞株；也可以通过基因工程技术等手段获得乙嘧酚纳米抗体，这些技术对本领域技术人员来说都是容易实现的；基于此，无论采用何种方法制备乙嘧酚单克隆抗体、乙嘧酚多克隆抗体或乙嘧酚纳米抗体，只要其使用了本发明提供的半抗原或完全抗原即属于本发明的保护范围。
[0127]
在本发明中公开的半抗原或完全抗原基础上，本领域技术人员容易想到采用合适的抗体制备方法制备出抗乙嘧酚的抗体，无论其采用何种动物进行免疫，无论其免疫条件或参数如何设置或改变，只要其使用了本发明所提供的半抗原或完全抗原，即属于本发明的保护范围。
[0128]
采用本发明提供的乙嘧酚完全抗原免疫宿主动物所制备的抗体或抗血清，能够与乙嘧酚特异性结合，具有较好的免疫效果。
[0129]
本发明提供一种检测乙嘧酚的试剂或试剂盒，含有上述技术方案所述乙嘧酚抗体或者上述技术方案所述制备方法制备得到的抗乙嘧酚抗体。
[0130]
本发明提供上述技术方案所述乙嘧酚抗体或者上述技术方案所述制备方法制备得到的抗乙嘧酚抗体或者上述技术方案所述的试剂或试剂盒在检测乙嘧酚中的应用。
[0131]
本发明提供的乙嘧酚半抗原的合成路径较简单，合成成本低，其溶解性以及稳定性好；且由本发明的完全抗原免疫宿主动物得到的抗血清的效价高，特性好，将该完全抗原免疫小鼠得到的脾细胞能够有效用于杂交瘤细胞的融合并制备抗乙嘧酚单克隆抗体。将该完全抗原免疫羊驼，采集羊驼外周血，收集其b淋巴细胞，通过噬菌体展示技术，构建噬菌体展示纳米抗体表达库，通过四轮固相竞争法淘选可得到特异性识别乙嘧酚的纳米抗体。本发明提供的乙嘧酚完全抗原所制备的乙嘧酚单克隆抗体、乙嘧酚多克隆抗体或乙嘧酚纳米抗体的特异性好、最低检测限值低，能够实现对乙嘧酚的特异性识别，可以用于建立乙嘧酚免疫学检测方法或检测试剂，具有广阔应用前景。
[0132]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0133]
实例中部分材料的来源：
[0134]
盐酸、十二水磷酸二氢钠、氯化钠、明胶、一水合柠檬酸、tween-20均购自国药集团化学试剂有限公司；无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)购自阿拉丁；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清白蛋白(bsa)和卵清白蛋白(ova)均购自sigma公司；羊抗鼠igg-hrp购自jackson公司。
[0135]
实施例1
[0136]
合成式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原：结构如下：
[0137][0138]
合成路线见图1。
[0139]
在氮气保护下，往干燥的thf(30ml)中加入nah(60％,1.20g,30mmol)，得到混合物后冷却到0℃；在搅拌下往混合物体系中加入乙酰乙酸乙酯(图1中的1，3.90g，30mmol)，然后在室温下搅拌30min，再往体系中加入5-溴-戊酸乙酯(图1中的2，4.18g，20mmol)；将反应混合物加热回流12h。降至室温，加入饱和的氯化铵溶液(10ml)，然后加入水(50ml)；用乙酸乙酯(萃取(50ml
×
2)；得到的有机相合并后，用饱和的食盐水(50ml)洗涤；硫酸钠干燥，浓缩后得到油状物；该油状物上硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1，v:v，洗脱)得到浅黄色油(3.28g，收率为60％)为式3所示结构的化合物(图1中的3)。
[0140]
将式4所示结构的化合物(乙基硫酸胍，8.5g，31mmol)溶解在甲醇(150ml)中,冰浴冷却到0℃，往其中加入30wt％的甲醇钠(11.2g，62mmol)的甲醇溶液，维持同样的温度搅拌30min；然后往体系中加入式3所示结构的化合物(16.0g，62mmol)，升温至70℃继续搅拌1h。得到的反应液浓缩除掉乙醇；往残留物中加入饱和的氯化铵溶液(200ml)；用乙酸乙酯萃取(100ml)；有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水洗(100ml)，硫酸钠干燥；浓缩后的残留物上硅胶柱层析分离(二氯甲烷:甲醇＝50:1，v:v，洗脱得到式5所示结构的化合物(12.4g，收率为71％)。
[0141]
将式5所示结构的化合物(11.56g，40mmol)溶解在乙醇(100ml)中，往其中加入氢氧化钠溶液(naoh 8.0g，100ml水)，得到的反应液在室温条件下搅拌反应16h。浓缩反应液，用醋酸调节ph到4，搅拌10min，有固体析出，过滤收集固体产物，固体产物用水洗(50ml)，然后用甲醇打浆(100ml)，干燥后得到白色固体为式i-1所示结构的乙嘧酚半抗原。
[0142]
图4为实施例1中式i-1所示乙嘧酚半抗原的液相色谱图；液相色谱图(图4)显示仅有一个样品峰，乙嘧酚半抗原分子式为c
12h19
n3o3，254.15，精确分子量理论值为253.30。
[0143]
实施例1制备的产品经液相色谱、lc-ms(图5)、1h nmr(图6)确证，为式i-1所示乙嘧酚半抗原：5-(2-(乙胺基)-4-羟基-6-甲基嘧啶-5-基)戊酸化合物，英文名称为：5-(2-(ethylamino)-4-hydroxy-6-methylpyrimidin-5-yl)pentanoic acid。
[0144]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ1.07(t,j＝6.4hz,3h),1.29-1.37(m,2h),1.44-1.52(m,2h),2.05(s,3h),2.19-2.28(m,4h),3.18-3.25(m,2h),6.12(s,1h),10.66(s,1h),11.91(s,1h)。
[0145]
实施例2
[0146]
合成式i-2所示乙嘧酚半抗原，结构如下：
[0147][0148]
合成路线见图2。
[0149]
称取实施例1制备所得式i-2所示乙嘧酚免疫抗原5.37mg(0.021mmol)，nhs 4.88mg(0.042mmol)和edc 8.13mg(0.042mmol)充分溶解于0.5ml无水dmf中，在4℃冰箱中磁力搅拌反应10h。待反应结束后，得到含有式i-2所示乙嘧酚半抗原的反应液，实施例2制备的含有式i-2所示乙嘧酚半抗原的反应液可直接用于与载体蛋白的缓冲溶液的偶联。
[0150]
实施例3
[0151]
合成式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原：
[0152][0153]
合成路线见图3。
[0154]
合成方法：
[0155]
将实施例2得到的含有式i-2所示乙嘧酚半抗原的反应液的上清液缓慢滴加入ova的pbs缓冲溶液中，其中，ova的pbs缓冲溶液由10mg的ova溶于1mlph值为7.4的pbs缓冲溶液混匀得到，式i-2所示乙嘧酚半抗原与ova的投料摩尔比为40:1，在25℃搅拌反应4h，将所得反应液用ph值为7.4、浓度为0.01mol/l的pbs缓冲溶液中透析六次，将透析完全的反应产物溶液稀释为1mg/ml的溶液。透析的作用在于去除未反应液中的式i-2所示乙嘧酚半抗原或其它小分子，得到式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原，即式i-1所述的乙嘧酚半抗原与ova的偶联物。
[0156]
maldi-tof-ms检测得到的ova(图7)和式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原(图8)单电荷离子峰为44721.036和47354.014。载体蛋白ova与式i-1所述的乙嘧酚半抗原的偶联比率的计算公式为：偶联比率＝(完全抗原分子量-载体蛋白分子量)/半抗原分子量。由偶联比率公式计算得到式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原的偶联比率为1:10。
[0157]
实施例4
[0158]
合成式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原：
[0159][0160]
将实施例2得到的含有式i-2所示乙嘧酚半抗原的反应液的上清液缓慢滴加入bsa的pbs缓冲溶液中，其中，bsa的pbs缓冲溶液由20mg bsa溶于5mlph值为7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)混匀得到，式i-2所示乙嘧酚半抗原与bsa的投料摩尔比为40:1，在25℃搅拌反应4h，将所得反应液用ph值为7.4、浓度为0.01mol/l的pbs缓冲溶液中透析六次，将透析完全的反应产物溶液稀释为1mg/ml的溶液，液氮速冻后，置于-20℃冻存待用。得到式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原，即式i-1所述的乙嘧酚半抗原与bsa的偶联物。
[0161]
maldi-tof-ms检测得到的bsa标准品(图9)和式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原(图10)单电荷离子峰67510.359和75544.340。由偶联比率公式计算得到式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原的偶联比率为1:31。
[0162]
实施例5
[0163]
乙嘧酚完全抗原的应用
[0164]
一、利用实施例4制备得到的式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原制备乙嘧酚抗体
[0165]
(1)取6～8周龄的balb/c小鼠作为实验动物(8周龄的balb/c小鼠体重约23～25g)。
[0166]
(2)初次免疫：由实施例4得到稀释好的式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原溶液(浓度为1mg/ml)，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原注射小鼠腹腔和背部皮下，注射总剂量为0.1mg乳化抗原/只。
[0167]
(3)加强免疫：初次免疫2周后，取1ml上述稀释好的式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原溶液，加入1ml弗氏不完全佐剂，充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原进行小鼠腹腔注射和背部皮下多点注射，注射总剂量为0.1mg乳化抗原/只。加强免疫每隔14天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫3天后，从小鼠眼眶采血，测定血清中乙嘧酚抗体效价，测试方法为：ic-elisa。包被抗原为1mg/ml的式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原，稀释血清为所需梯度，待效价≥1:64000后(效价定义为零孔显色值为1.0左右时，血清的稀释倍数)，眼球摘除采血，血液37℃恒温培养箱静置30min后，再于4℃冰箱中静置2h，然后于离心机中4℃、10000r/min离心5min后，分离血清，即得到乙嘧酚抗血清。用于下述实验。
[0168]
二、抗乙嘧酚血清中抗体的效价检测
[0169]
下述实验中所用的各种缓冲液如下：
[0170]
(1)包被缓冲液(cbs，ph 9.6，0.05m碳酸盐缓冲液):称取na2co31.5g、nahco32.94 g，超纯水定容至1000ml；
[0171]
(2)磷酸盐缓冲液(0.01m pbs,ph 7.4)：称取kh2po40.2 g、nacl 8g、nah2po4·
12h2o 2.92g，超纯水定容至1l；
[0172]
(3)洗涤缓冲液(pbst)：在配好的磷酸缓冲溶液中加入体积比为0.1％的tween-20；
[0173]
(4)样品稀释液(pbstg)：在配好的磷酸缓冲溶液中加入体积比为1％的tween-20、1g明胶(微波炉加热融化)；
[0174]
(5)底物缓冲液(ph 5.5)：称取na2hpo3·
12h2o 9.22g、一水合柠檬酸2.55g、量取0.5ml的tween-20，超纯水定容至1l；
[0175]
(6)终止液(1m hcl)：量取蒸馏水440ml，逐滴加入98％(体积/体积)浓盐酸40ml并搅拌。
[0176]
(一)测定抗乙嘧酚血清中抗体的效价和抑制率
[0177]
1、式iii-1所示结构的乙嘧酚包被抗原溶液的配制
[0178]
将上述实施例3制备的式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原，用cbs按1:1000、1:2000、1:4000和1:8000进行梯度稀释，得到不同浓度的式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原的包被抗原溶液。
[0179]
2、乙嘧酚标准品溶液的配制
[0180]
(1)称取10mg乙嘧酚标样，充分溶解于10ml甲醇中，即得到1mg/ml乙嘧酚标准品溶液。
[0181]
(2)用pbstg将上述(1)的1mg/ml乙嘧酚标准品溶液配制成终浓度为1000ng/ml的乙嘧酚标准品溶液。
[0182]
3、乙嘧酚抗血清稀释液的配制
[0183]
将上述步骤制备的乙嘧酚抗血清用pbstg按需进行梯度稀释，得到乙嘧酚抗血清稀释液。
[0184]
4、乙嘧酚抗血清效价与抑制率测定
[0185]
①
包被：在96孔酶标板中每孔加入100μl步骤1配制得到的式iii-1所示结构的乙嘧酚完全抗原的包被抗原溶液，37℃恒温孵育3h，用pbst洗涤3次，甩干。
[0186]
②
竞争：零孔中，每孔加入50μlpbstg；抑制孔中，每孔加入50μl步骤2制备得到的乙嘧酚标准品溶液。
[0187]
③
将乙嘧酚抗血清稀释液加入酶标板中(50μl/孔)，置于37℃条件下孵育30min，用pbst洗板3次，甩干。
[0188]
④
加酶标二抗：用pbs(0.1m，ph＝9.6)将羊抗鼠酶标二抗(igg-hrp，jackson公司)稀释到工作浓度，每孔加100μl，37℃条件下孵育30min，用pbst洗板3次，甩干。
[0189]
⑤
显色：显色底物现用现配，每孔加入100μltmb单组分显色液，室温下避光显色15min。
[0190]
⑥
终止与检测：每孔加入50μl 1m hcl终止液，终止反应，用酶标仪在450nm处检测各孔的吸光度值(od值)。
[0191]
⑦
效价确定：od值为1.0左右时，将乙嘧酚抗血清的最大稀释倍数为将乙嘧酚抗血清效价。
[0192]
⑧
特异性确定:根据抑制率来判断血清的特异性。
[0193]
抑制率的计算公式：抑制率＝[(对照孔od值-抑制孔od值)/对照孔od值]
×
100％，第三次、第四次免疫后，乙嘧酚抗血清效价结果如表1所示。
[0194]
表1抗乙嘧酚血清效价和抑制率(tmb显色15min，1000ng/ml标样抑制)
[0195][0196]
注：i表示酶标板中的抑制孔，c表示酶标板中的对照孔，ir表示抑制率，k表示1000倍。
[0197]
表2乙嘧酚融合小鼠的血清效价和抑制率(tmb显色15min，1000ng/ml标样抑制)
[0198]
[0199][0200]
注：i表示酶标板中的抑制孔，c表示酶标板中的对照孔，ir表示抑制率，k表示1000倍。
[0201]
表1结果表明，第四次免疫后，当包被原(乙嘧酚半抗原-ova)稀释8000倍时，抗乙嘧酚的血清效价为256000，抑制率为76.2％。说明上述实施例4制备的式iii-2所示结构的乙嘧酚完全抗原具有免疫原性并且特异性较好，可制备出抗乙嘧酚的抗体。
[0202]
表2结果表明，融合小鼠的血清效价较高，且抑制率为80％以上。说明上述实施例5制备的式iii-2所示结构的乙嘧酚融合小鼠的脾细胞可以用于融合实验，制备抗乙嘧酚的抗体。
[0203]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。