一种可逆终止子核苷酸3’-OH保护基团的引入方法与流程

一种可逆终止子核苷酸3
’‑
oh保护基团的引入方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种可逆终止子核苷酸3
’‑
oh保护基团的引入方法。


背景技术：

2.基因测序是遗传学及分子生物学一个重要的科研工具，随着测序技术的发展，测序价格大大降低及测序仪的能力越来越高，测序技术不仅仅局限于科研市场，越来越多的应用到面向大众的普通消费市场，特别是医疗市场和临床市场。其中，二代测序ngs技术迅猛发展，凭借其低成本、高通量的优势在很多领域得到了应用，在很多探索性研究中，如在新物种基因组的de novo测序(即从头测序，是不依赖于任何参考序列对某物种进行测序，通过生物信息学分析手段进行拼接、组装，从而获得该物种全基因序列图谱)、目标区域或全基因组重测序、转录组测序、宏基因组测序、表现修饰测序等领域都取得了突破性的进展。
3.边合成边测序技术(sbs)是世界范围内广泛使用的ngs技术，全球90％以上的测序数据都来自sbs技术。在最常用的sbs方法中，可逆终止子核苷酸(nrt)用于确定dna模板的序列每个rt包含修饰的核苷酸，其包括∶(1)保护基团，保护基团(如甲基叠氮，乙烯基，双硫键基团等)确保通过dna聚合酶仅将单个碱基添加到生长dna拷贝链的3'端，(2)荧光基团，荧光基团能够由相机检测到，不同的nrt会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定dna序列的顺序。在最常见的sbs方法中，将模板和测序引物固定在芯片上，并将该支撑物暴露于四种dna核苷酸类似物中，每一种类似物包含通过可裂解链附着到含氮碱基的不同荧光团，以及脱氧核糖3'-oh位的3'-o-保护，以及dna聚合酶。只有正确的互补碱基退火到靶，随后在引物的3’末端处掺入。洗掉未掺入的核苷酸，并光学成像。引入裂解试剂以裂解链并释放荧光团并去除3'-o-保护基团，从而使3'-oh再生，然后可以重复该循环。对于四种碱基中的每一种使用不同的荧光颜色标记，使得在每个测序循环中，可以通过其荧光信号鉴定掺入的nrt的身份。
4.在各式各样的3
’‑
oh保护基团中，又以甲基叠氮基团和双硫键基团最具有代表性，当今占据全球测序设备和试剂耗材主要市场的illumina公司的核心技术之一的测序试剂荧光标记可逆终止子核苷酸的3
’‑
oh保护基团就是甲基叠氮基团，尽管含甲基叠氮基团或双硫键基团的nrt被广泛使用，但其制备方法仍然需要改进。在引入3
’‑
oh上的甲基叠氮基团时，通常是在过量的二甲基亚砜(dmso)和醋酸酐的作用下将3
’‑
oh转化为3
’‑
o-ch
2-s-ch3，分离纯化后再用pocl3将其转化为3
’‑
o-ch
2-cl,最后和nan3反应将叠氮(n3)基团引入，生成3
’‑
o-ch
2-n3，合成路线示例如下所示：
[0005][0006]
而在引入3
’‑
oh上的二硫键基团时，也是需要先在过量的dmso和醋酸酐的作用下将3
’‑
oh转化为3
’‑
o-ch
2-s-ch3，分离纯化后再用pocl3将其转化为3
’‑
o-ch
2-cl,最后和硫代对甲苯磺酸钾盐以及硫醇(sh-r)反应将二硫键基团引入，生成3
’‑
o-ch
2-ss-r。
[0007]
在这些系列反应步骤中，存在一些弊端a)dmso和醋酸酐会生成等摩尔的二甲基硫醚，有难闻的恶臭气味，低浓度的二甲基硫醚蒸气引起恶心，食欲减退，高浓度蒸气对中枢神经系统有麻痹作用，在实际生产和实验后处理过程中，会产生大量含有恶臭味二甲基硫醚的废水和废液，不能随意排放，而且会被固废液处理公司拒收，为后处理带来了一定的困难；此外二甲基硫醚挥发性强，在处理过程中，常常伴随恶臭味从实验室或通风设备溢出，引起周边公司或环保部门的不满和投诉；b)有不可控副产物3
’‑
o-ac生成，特别是在做批量生产时，副产物3
’‑
o-ac核苷的比例更高，常常有一半以上比例，而且3
’‑
o-ac核苷的化学性质与目标产物3
’‑
o-ch
2-n3核苷极为相近，分离困难。


技术实现要素：

[0008]
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是为了提供一种采用一锅法进行可逆终止子核苷酸3
’‑
oh保护基团的引入方法。
[0009]
为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0010]
本发明提供了一种可逆终止子核苷酸3
’‑
oh保护基团的引入方法，包括如下步骤：
[0011]
步骤s1、向2
’‑
脱氧核苷中加入甲醛(h2co)和三乙烯二胺(dabco)，反应生成中间产物1；
[0012]
步骤s2、在氮气的保护下，向中间产物1中加入n,n'-二甲基硫脲(dmtu)和n-氯代丁二酰亚胺(ncs)，反应生成中间产物2；
[0013]
步骤s3、中间产物2与含有叠氮基团的化合物或含有硫的化合物反应生成含有3
’‑
oh保护基团的可逆终止子核苷酸(nrt)。
[0014]
在一些实施例中，2
’‑
脱氧核苷具有下列结构：
[0015][0016]
其中，base为碱基或碱基类似物；
[0017]
r1为羟基保护基团；
[0018]
r2为h、卤素、不饱和氨基脂肪链或不饱和羟基脂肪链中的至少一种。
[0019]
在一些实施例中，所述碱基或碱基类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或上述任一种碱基的类似物中的至少一种。
[0020]
在一些实施例中，所述碱基或碱基类似物为
[0021][0022]
在一些实施例中，所述羟基保护基团为
[0023][0024]
在一些实施例中，所述不饱和氨基脂肪链为
[0025][0026][0027]
其中，n为1、2、3或4，r3为氨基保护基团。
[0028]
在一些实施例中，所述氨基保护基团为
[0029][0030]
在一些实施例中，所述不饱和羟基脂肪链为
[0031][0032]
其中，n为1、2、3或4，r1为羟基保护基团。
[0033]
在一些实施例中，当中间产物2与含有叠氮基团的化合物生成将叠氮基团作为3
’‑
oh保护基团的可逆终止子核苷酸时，所述叠氮基团作为3
’‑
oh保护基团的可逆终止子核苷酸为
[0034][0035]
在一些实施例中，当中间产物2与含有叠氮基团的化合物生成将叠氮基团作为3
’‑
oh保护基团的可逆终止子核苷酸时，所述含有叠氮的基团为叠氮化钠，合成路线为：
[0036][0037]
在一些实施例中，当中间产物2与含有硫的化合物反应生成将二硫键基团作为3
’‑
oh保护基团的可逆终止子核苷酸时，所述二硫键基团作为3
’‑
oh保护基团的可逆终止子核苷酸为
[0038][0039]
其中，r为c1-c4带卤素或不带卤素的脂肪链。
[0040]
在一些实施例中，所述c1-c4带卤素或不带卤素的脂肪链为
[0041][0042]
其中，x为f,cl,br,i。
[0043]
在一些实施例中，当中间产物2与含有硫的化合物反应生成将二硫键基团作为3
’‑
oh保护基团的可逆终止子核苷酸时，所述含有硫的化合物为hs-r，反应式为：
[0044][0045]
本发明还提供了一种采用一锅法将2
’‑
脱氧核苷转化为3
’‑n3-2’,3
’‑
双脱氧核苷衍生物的方法，所述3
’‑n3-2’,3
’‑
双脱氧核苷衍生物为
[0046][0047]
合成路线为：
[0048][0049]3’‑n3-2’,3
’‑
双脱氧核苷衍生物常用于将n3基团引入至合成的rna中，使其具备点击化学反应功能。
[0050]
本发明提供的上述技术方案的有益效果至少包括：
[0051]
本发明的一种可逆终止子核苷酸3
’‑
oh保护基团的引入方法，采用一锅法引入3
’‑
oh保护基团，制备3
’‑
o-ch
2-n3或3
’‑
o-ch
2-ss-r核苷衍生物，在此基础上还提供了一种3
’‑
n3核苷衍生物的制备方法，反应操作简单，后处理方便，只需一次柱层析纯化就可以得到目标产物，具有较高的产率，且无需使用二甲基亚砜和醋酸酐，避免了难处理，具有恶臭味、毒性较大的二甲基硫醚的生成，同时也避免了副产物3
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o-ac核苷的产生。
附图说明
[0052]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍。通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
[0053]
图1为本发明实施例1的化学反应式；
[0054]
图2为本发明实施例2的化学反应式；
[0055]
图3为本发明实施例3的化学反应式。
具体实施方式
[0056]
下列实施例仅用于对本发明进行详细说明，但应理解的是本发明的范围并不限于这些实施例。
[0057]
实施例1
[0058]
向装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中加入1.15g,2.0mmol的3
’‑
oh化合物1-1，0.07g,2.2mmol的甲醛，0.22g,0.2mmol的dabco，在氮气保护条件下，加入5ml无水环丁砜,在80℃下磁力搅拌30min后恢复至室温，加入91mg,0.9mmol的dmtu，400mg,3.0mmol的ncs,采用紫外灯在350nm波长的紫外线照射下搅拌反应2h，撤走紫外灯，置于冰浴中，待室温降至零度后，加入390mg,6.0mmol的nan3,搅拌10min后，将反应液倒入到冰水中淬灭反应。用dcm萃取，收集有机相，饱和食盐水洗涤，干燥后旋干，硅胶柱层析纯化，洗脱剂以体积计为二氯甲烷：甲醇＝30:1,即可得到0.85g产物3
’‑
o-ch
2-n3化合物2-1，产物为白色泡沫状固体，产率为67％。反应式如图1所示，其中，化合物1-1-1和化合物1-1-2为中间产物。产物的核磁共振氢谱和质谱结果如下：1hnmr(600mhz,cdcl3):
δ
h[ppm]:δ8.77(s,1h),8.12(s,1h),7.44(d,1h),6.11(t,1h),4.60
–
4.46(m,3h),4.21(q,1h),3.98(dd,1h),3.86(dd,1h),3.66(dd,1h),3.47(d,2h),3.15(m,6h),2.59
–
2.45(m,1h),2.02(ddd,1h),0.98(s,9h),0.21(d,6h)；
[0059]
esi-ms(c
26h43
f3n8o5s):655.08[m+na]
+
。
[0060]
实施例2
[0061]
向装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中加入1.15g,2.0mmol的3
’‑
oh化合物1-2，0.07g,2.2mmol的甲醛，0.22g,0.2mmol的dabco。在氮气保护条件下，加入5ml无水环丁砜,在80℃下磁力搅拌30min后恢复至室温，加入91mg,0.9mmol的dmtu，400mg,3.0mmol的ncs,采用紫外灯在350nm波长的紫外线照射下搅拌反应2h，撤走紫外灯，置于冰浴中，待室温降至零度后，加入390mg,6.0mmol的nan3,搅拌10min后，将反应液倒入到冰水中淬灭反应。用dcm萃取，收集有机相，饱和食盐水洗涤，干燥后旋干，硅胶柱层析纯化，洗脱剂以体积计为二氯甲烷：甲醇＝30:1,即可得到0.85g产物3
’‑
o-ch
2-n3化合物3-1产物为白色泡沫状固体，产率为67％。反应式如图2所示，其中，化合物1-2-1和化合物1-2-2为中间产物。产物的核磁共振氢谱和质谱结果如下：1hnmr(600mhz,cdcl3):
δ
h[ppm]:δ9.66(s,1h),8.08(s,1h),6.31(dd,1h),4.92(d,1h),4.80(d,1h),4.53(dt,1h),4.19(q,1h),3.92(m,2h),2.64
–
2.50(m,3h),2.04(m,1h),1.36(s,9h),0.98(s,9h),0.21(d,6h)；esi-ms(c
21h38
n2o5s2si):491.02[m+h]
+
。
[0062]
实施例3
[0063]
向装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中加入0.94g,2.0mmol的3
’‑
oh化合物1-3，91mg,0.9mmol的dmtu，400mg,3.0mmol的ncs。在氮气保护条件下，加入5ml无水dcm，采用紫外灯在350nm的紫外线照射下搅拌反应2h，撤走紫外灯，置于冰浴中，待室温降至零度后，加入5ml无水dmf，390mg,6.0mmol的nan3,搅拌10min后，将反应液倒入到冰水中淬灭反应。用dcm萃取，收集有机相，饱和食盐水洗涤，干燥后旋干，硅胶柱层析纯化，洗脱剂以体积计为二氯甲烷：甲醇＝30:1,即可得到0.68g产物3
’‑
n3化合物4-1，产物为白色固体，产率为
69％。反应式如图3所示，其中，化合物1-3-1为中间产物。产物的核磁共振氢谱和质谱结果如下：1hnmr(600mhz,cdcl3):
δ
h[ppm]:δ9.14(s,1h),8.80(s,1h),8.35(s,1h),8.07(m,2h),7.66(m,1h),7.45(m,2h),6.55(m,1h),4.15(dt,1h),3.95
–
3.82(m,2h),2.80
–
2.61(m,2h),1.92(m,1h),0.94(s,9h),0.13(s,6h)；esi-ms(c
23h30
n8o3si):495.52[m+h]
+
.
[0064]
以上说明书中描述的只是本发明的具体实施方式，各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制，所属技术领域的普通技术人员在阅读了说明书后可以对以前所述的具体实施方式做修改或变形，而不背离本发明的实质和范围。