本发明涉及荧光猝灭剂。本发明特别涉及经取代的二氮烯基苯胺及其核酸缀合物、复合物和盐，其可潜在地用作化学和生物科学(例如细胞成像应用、诊断、荧光和非荧光标签、药物和其他可用应用)中的荧光猝灭剂。本发明还涉及经取代的二氮烯基苯胺及其核酸缀合物、复合物和盐的合成。更具体地，本发明涉及2,2’-((4-((2,5-双取代的-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-2/3-取代的-苯基)氮烷二基)二烷醇，用于制备所述化合物的方法，及其在细胞成像应用、诊断、荧光和非荧光标签、药物和其他可用应用中作为荧光猝灭剂的用途。
背景技术：
1、用于检测和定量化学和生物物质的成本效益技术的发展广泛地提高了药物、诊断和装置领域中的高科技创新。其已成为鉴定从微量水平到整个肽、蛋白质范围以及核酸到其他药物重要物质的物质的主要领域之一。这些研究与我们的生活错综复杂地交织在一起，因为其在鉴定疾病方面发挥着至关重要的作用，同时其可用于检测和/或定量生物学上重要的实体。
2、鉴定具有诊断价值的分析物的方法可基于其与化学和生物环境结合的独特特征的特定组。到目前为止，存在许多结合方法，例如抗原-抗体和蛋白质-酶相互作用、核酸修饰系统(northern印迹)和标记技术。已经开发了广泛多种标记用于寡核苷酸的快速和有效的桌面标记，并且这些方法可用于制备少量检测探针以及当需要进行突变分析时是有用的。
3、使用荧光光谱可检测的标记是非常令人感兴趣的，因为荧光标记的合成是可调的。可以通过简单地引入不同的基团来衍生它们，以产生用于不同种类部分的广泛多种的荧光标记。除此之外，它们是可容易商购的。该方法基于荧光化合物将吸收的能量从光转移至附近分子的能力，并已被用于开发核酸检测的均质化方法。
4、为了实现稳健、灵敏并且特异性良好的实时核酸倍增测定，使用合适的荧光团和猝灭剂标记对是绝对必要的。这包括测定中使用的杂交探针的类型以及待检测的靶标的数目。
5、在它们的激发态下，除了发射能量光子之外，荧光团可通过数种方式失去激发能量。这样的荧光猝灭可通过分子运动(动态猝灭)、与其他物质的激发态复合(光漂白)、接触猝灭(静态猝灭)或者向另一分子的能量转移(荧光共振能量转移，或fret(fluorescenceresonance energy transfer))来发生。许多核酸荧光检测技术使用带有荧光标记的探针，其通过猝灭相邻第二荧光标记的荧光或者通过使用荧光猝灭剂对来发挥作用。用报道染料和猝灭染料双标记的探针测量其荧光的变化以监测任何生物化学事件。这些事件负责报道子-猝灭剂距离的变化，从而导致观察到的荧光变化。(chem.commun.,2010,46,8154–8156)
6、实时核酸扩增测定具有获得更好的定性和定量结果的显著能力。另外，这些测定可以在密封管中进行，避免污染。荧光核酸杂交探针包含宽范围不同的配位荧光团和猝灭剂对。一些方法基于相互互补的寡脱氧核糖核苷酸对，其中寡脱氧核糖核苷酸中的一者保留作为单链靶序列的探针。一个寡脱氧核糖核苷酸的5’末端用供体荧光团标记并且另一个寡脱氧核糖核苷酸的3’末端用接受体荧光团标记。(nucleic acids research，2002年第30卷第21期e122)。
7、包括报道子-猝灭剂分子对的探针的重要应用之一是其在核酸扩增反应例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)中的使用，以检测靶核酸序列的存在和扩增。(acc.chem.res.2011,44,2,83–90)。
8、在taqman测定中，供体和猝灭剂优选位于探针的3’末端和5’末端，对于该测定因为能量转移的效率随着报道子和猝灭剂之间距离的逆六次幂(inverse sixth power)而降低。因此，如果猝灭剂不足够接近报道子以实现最有效的猝灭，则来自探针的背景发射可以相当高。(nucleic acids res.2011,39,e112)。
9、荧光-猝灭剂线性对探针是实时pcr的标准工具，高信噪比、低成本以及与不同pcr技术的相容性使其非常适合作为广泛范围应用中基因定量的工业标志物标准。黑洞猝灭剂(black hole quencher)染料bhq0、bhq1、bhq2和bhq3已被用于猝灭整个可见光谱范围。fam和bhq染料表现出顶级的性能，如在不同的科学报告中所综述的。taqman探针可用于基因表达的定量实时pcr分析，其包含pcr引物和taqman探针，所述taqman探针在5’末端具有染料标记(fam)并且在3’末端具有小沟结合物(minor groove binder，mgb)和非荧光猝灭剂(non-fluorescent quencher，nfq)/暗猝灭剂。bhq-1用于猝灭绿色和黄色染料，例如fam、tet和hex。bhq-2和bhq-3被报道用于猝灭橙色或红色染料，例如tamra、德克萨斯红(texasred)和cy5。
10、发明目的
11、本发明的主要目的是提供经取代的二氮烯基苯胺及其核酸缀合物、复合物和盐，其可潜在地用作化学和生物科学(例如细胞成像应用、诊断、荧光和非荧光标签、药物和其他可用应用)中的荧光猝灭剂。
12、本发明的另一个目的是提供用于制备经取代的二氮烯基苯胺及其核酸缀合物、复合物和盐的方法。
13、本发明的又一个目的是在化学和生物科学(例如细胞成像应用、诊断、荧光和非荧光标签、药物和其他可用应用)中使用经取代的二氮烯基苯胺及其核酸缀合物、复合物和盐。
技术实现思路
1、因此，本发明涉及经取代的二氮烯基苯胺、其合成以及荧光猝灭特性的研究及其核酸缀合物、复合物、盐，其可潜在地用作化学和生物科学(例如细胞成像应用、诊断、荧光和非荧光标签、药物和其他可用应用)中的荧光猝灭剂，以及制备所述新的化合物的方法。
2、因此，本发明提供了通式i化合物、其核酸缀合物、复合物和盐，
3、
4、其中r独立地选自氢和卤素；
5、r1和r2独立地选自氢、经取代或未经取代的(c1-c4)烷基和(c1-c6)烷氧基；
6、r3选自羟基、卤素、(c1-c6)烷氧基、经取代或未经取代的(c1-c4)烷基、硫代烷基(sc1-c6)、甲基氨基和二甲基氨基；
7、r4选自氢、羟基、卤素、(c1-c6)烷氧基和经取代或未经取代的(c1-c4)烷基；
8、m和n选自0至3；
9、y1和y2独立地选自氢、(c1-c6)烷基、乙二醇、经取代或未经取代的烷基芳基、氧代-链烷酸、环氧基、n-羟基琥珀酰亚胺酯、n-羟基苯并三唑酯、酰卤(acid halide)、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基酯、单核苷酸单元、具有或不具有通过核苷基团连接的单独的磷酸酯或多磷酸酯基团的两个或更多个单核苷酸单元。
10、在本发明的一个优选实施方案中，式i化合物选自：
11、i.2,2’-((4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-甲氧基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(1)，
12、ii.2,2’-((4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-乙氧基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(2)，
13、iii.2,2’-((4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-丙氧基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(3)，
14、iv.2,2’-((3-丁氧基-4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(4)，
15、v.2,2’-((4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-(己氧基)苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(5)，
16、vi.2,2’-((4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-甲基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(6)，
17、vii.2,2’-((4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-2,5-二甲氧基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(7)，
18、viii.2,2’-((3-溴-4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(8)，
19、ix.2,2’-((4-((4-((2,6-二氯-4-硝基苯基)二氮烯基)-2,5-二甲氧基苯基)二氮烯基)-3-甲氧基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(9)，
20、x.2,2’-((4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-羟基苯基)氮烷二基)双(乙-1-醇)(10)，
21、xi.4-(2-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-甲氧基苯基)氨基)乙氧基)-4-氧代丁酸(11)，
22、xii.4-(2-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-乙氧基苯基)氨基)乙氧基)-4-氧代丁酸(12)，
23、xiii.4-(2-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-丙氧基苯基)氨基)乙氧基)-4-氧代丁酸(13)，
24、xiv.4-(2-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(3-丁氧基-4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)-乙氧基)-4-氧代丁酸(14)，
25、xv.4-(2-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-(己氧基)苯基)氨基)-乙氧基)-4-氧代丁酸，(15)以及
26、xvi.4-(2-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(4-((2,5-二甲氧基-4-((4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)-3-甲基苯基)氨基)-乙氧基)-4-氧代丁酸(16)。
27、本发明还提供了用于制备通式i化合物及其核酸缀合物、复合物、盐的方法，其中r、r1、r2、r3、r4、m、n、y1和y2如上所限定，所述方法包括以下的步骤：
28、
29、a.使未经取代或经取代的4-硝基苯胺在hcl中的溶液与亚硝酸钠在蒸馏水中的溶液在0℃下反应以形成重氮盐，随后与经取代的苯胺反应以形成式s1化合物；
30、b.使经取代的苯胺与经取代的烷基卤化物的混合物在存在碱的情况下反应以形成式s2化合物；
31、c.使在hcl中的式s1化合物与亚硝酸钠的溶液反应以形成重氮盐，然后使其与式s-2化合物在存在naoac缓冲液的情况下反应以获得具有通式i的化合物，以及
32、d.将通式i化合物从反应混合物中分离并通过用有机溶剂洗涤或通过色谱来纯化。
33、在本发明的一个优选实施方案中，上述方法的步骤a至c在存在选自ch3cn、二甲基亚砜、水和四氢呋喃的有机溶剂的情况下在0℃至100℃的温度下进行1分钟至3天的时间。在一个优选实施方案中，本发明提供了包括以下步骤的方法：
34、
35、a)使在无水dcm中的其中y1、y2＝oh并且m、n＝1的化合物s2在存在碱(dipea)的情况下与dmt-cl在室温下在惰性气氛下反应以得到化合物s3；
36、b)使s3与琥珀酸酐和dmap在有机溶剂中反应12小时至48小时以得到化合物s4，以及
37、c)使s1的重氮盐与s4反应以获得具有通式i的化合物。
38、本发明还提供了用于制备通式i缀合物化合物的方法，其中q是式1化合物，所述方法包括以下的步骤：
39、
40、a.使式s4的化合物与式s5的固体支持物cpg珠的胺官能团偶联以产生s6，随后使dmt基团去保护以获得s7；
41、b.使s7与核苷酸亚磷酰胺反应以形成寡核苷酸s8，随后用己炔基-亚磷酰胺进行5’修饰以得到产物s9，以及
42、c.用碱处理s9以将寡核苷酸从固体支持物上切割以获得s10，以及
43、d.使s10与荧光染料叠氮化物反应以提供通式s12的寡核苷酸探针。
44、本发明提供了通式i化合物，其可用于分析核酸(dna、rna)、肽、化学品、药物、微生物和其他具有诊断重要性的生物物质。
45、本发明提供了通式i化合物，其可用于开发用于检测物质、激素、病原微生物和病毒、抗体和酶以及核酸，特别是与疾病状态有关的那些的诊断试剂盒。
46、本发明提供了通式i化合物，其可用于在基于荧光的成像和/或细胞分析、生物流体、化学混合物和/或其他可用应用中用于检测/捕获离子的荧光探针、标签、标志物、诊断、离子传感器、药物的制备。
47、本发明还提供了通式i化合物与乙酰基、叠氮化物、n-羟基-琥珀酰亚胺、氧代-链烷酸、乙醇酸盐/酯、硫醇、胺、氢氧化物、马来酰亚胺、四嗪、磷酸盐/酯、钠盐、钾盐或亚磷酰胺的组合物。
48、在本发明的一个优选实施方案中，通式i化合物可用于制备双标记的探针，并在rtpcr或其他相关检测系统中以单、双重和多重对其进行分析。
49、在本发明的一个实施方案中，其中该化合物可用于化学和生物科学中的荧光猝灭剂。
50、在本发明的另一个实施方案中，其中该化合物显示出宽的猝灭范围(在450nm至700nm的nm之间)。
51、此外，本发明提供了具有通式i的化合物，其可潜在地用作化学和生物科学(例如细胞成像应用、荧光和非荧光标签以及其他可用的生物应用，例如开发诊断试剂盒)中的荧光猝灭剂。