一种免疫调节肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药及生物工程领域，涉及一种免疫调节肽及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 现代营养学研宄发现：人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以小肽形式 消化吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小，进一步的试验又揭示了小肽的吸收比游离 氨基酸的吸收更为迅速。肽营养作用的另一新认识是蛋白质在酶解过程中可以产生一些具 有特殊生理调节功能的生物活性肽。这些生物活性肽在调节胃肠道运动、调节免疫系统、 抗高血压、抗菌、抗血栓、抗病毒、抗癌、清除自由基和促进矿物元素吸收等方面发挥着重要 作用。这些生物活性肽本身以非活性状态存在于蛋白质氨基酸序列之中，当用适当的蛋白 酶进行体外水解或在胃肠道消化过程中以及食品加工过程中，它们的活性就被释放出来。 尽管其它动物和植物蛋白质中也包含活性肽序列，但是乳蛋白是目前生物活性肽的主要来 源，对其研宄最为深入。
[0003] 免疫活性肽具有能刺激多核淋巴细胞，促进淋巴细胞分化和成熟，转移免疫信息， 增强机体免疫机能等一系列的生物学功能。大量试验表明乳蛋白中隐含有许多免疫调节肽 序列，这些免疫调节肽对免疫系统具有重要的调节功能。我们借助超滤技术分离出母乳中 小于IOKDa的多肽成分，进一步借助串联质谱技术对其具体组成进行鉴定分析。结果发现 这些多肽主要是从人β-酪蛋白（Homo sapiens beta casein，基因 Bank号：NM_001891) 中断裂下来的片段，天然存在于母乳中。现有技术中没有对这些片断及其功能进一步研宄 的报道，为此，我们筛选了一些多肽进行深入的研宄。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种免疫调节肽。
[0005] 本发明的另一个目的是提供上述免疫调节肽的制备方法。
[0006] 本发明还有一个目的是提供上述免疫调节肽的应用。
[0007] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0008] 一种免疫调节肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。命名为Caseinlll。
[0009] 表达上述免疫调节肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 所述多肽的扩增引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，下游引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0011] 所述免疫调节肽的制备方法，该方法包括下列步骤：
[0012] a.构建上述多肽的表达载体pSUMO ;
[0013] b. pSUMO融合蛋白的诱导表达；
[0014] c. pSUMO融合蛋白的纯化、收集；
[0015] d.重组抗菌肽的纯化、收集。
[0016] 所述的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0017] a.构建上述多肽（SEQ ID NO :1)的表达载体pSUMO :
[0018] 人工合成该多肽核酸序列，利用上述的上下游引物通过PCR技术扩增出含有 Bsal、HindIII酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回收产物双酶切后载入pSUMO载 体；
[0019] b. pSUMO融合蛋白的诱导表达：
[0020] 1)测序正确的质粒转入大肠杆菌（BL21)，接种于含卡那霉素的LB培养液培养；
[0021] 2)收集菌体，重悬后加入IPTG诱导pSUMO融合蛋白表达；
[0022] c. pSUMO融合蛋白的纯化：
[0023] 诱导表达后的菌液沉淀用Ni-NTA Binding-Buffer重悬后，超声破碎，离心，取上 清，上清液上样至Ni-NTA亲和层析柱，洗脱pSUMO融合蛋白，收集洗脱液，SDS-PAGE电泳分 析；
[0024] d.重组抗菌肽的纯化、收集：
[0025] 采用SUMO酶对pSUMO融合蛋白进行酶切，利用Ni-NTA-S印harose CL-6B亲和层 析柱去除SUMO标签或没有被切割的SUMO融合蛋白，洗脱重组抗菌肽，电泳分析，收集重组 抗菌肽。
[0026] 所述的免疫调节肽在制备促T淋巴细胞增殖的药物中的应用。
[0027] 所述的免疫调节肽在制备奶制品添加剂中的应用。
[0028] 本发明有益效果：
[0029] 本发明提供的免疫调节肽具有很强的促T淋巴细胞增殖作用，能够用于制备促T 淋巴细胞增殖的药物。该调节肽是母乳来源，母乳作为新生儿最重要的食物，具有很高的安 全性。另外，新生儿免疫力和抵抗力都比较低下，该肽还可以用于制备奶制品添加剂。
[0030] 本发明提供的多肽可以通过化学合成得到，但是合成的成本高，因此，本发明还提 供了该多肽的基因重组技术制备方法，该制备方法简单易行，成本低，易于产业化应用。
[0031] 由于SUMO除了具有传统融合标签的促进可溶性的特性外，还具有分子伴侣功能， 能促进目的蛋白的正确折叠等特点，同时对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋 白的稳定性。本研宄中我们成功构建了多肽与SUMO融合表达载体，经诱导表达、酶切、纯化 后可大量获取可溶性多肽，与化学合成比大大降低了获取多肽的成本。
【附图说明】
[0032] 图1是化学合成的免疫调节肽促进T淋巴细胞的MTT增殖实验。
[0033] 图2是切割后纯化后的重组多肽Tricine/SDS-PAGE电泳。
[0034] 其中：1 :蛋白Marker ;2 :切割后的重组多肽
[0035] 图3是免疫调节肽促进T淋巴细胞增殖的流式细胞检测图。
[0036] 其中：PBS作为control，10ug/ml免疫调节肽作用效果，5ug/ml免疫调节肽作用效 果。（上排是峰图，下排是散点图）
【具体实施方式】
[0037] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0038] 实施例1
[0039] 1.该多肽具有一下的序列特征：
[0040] 氨基酸序列：GRVMPVLKSPTIPFFDPQIPK(SEQ ID NO :1)
[0041] 核苷酸序列：
[0042] GGCAGAGTGATGCCTGTCCTTAAATCTCCAACGATACCCTTTTTTGACCCTCAAATCCCAAAA(SEQ ID NO ：2)
[0043] 具有等电点（pi) :9· 99,分子量（Mw) :2367. 88。
[0044] 2.化学合成该多肽后，MTT实验发现该肽具有很强的促T淋巴细胞增殖的作用 (见图1)。
[0045] 采用FluoroBcads? T淋巴细胞分离试剂（ONE LAMBDA，US)分离人血液T淋巴细 胞，RPMI 1640(含 10% FCS，100U/ml penicillin/streptomycin)培养液调整细胞浓度至 约4X IO6个/ml。采用传统的MTT法检测化学合成的该免疫调节肽（化学合成肽）对T淋 巴细胞增值的作用。在96孔板中每孔加入50 μ 1细胞，150 μ I RPMI 1640培养液。再分 组依次加入该化学合成肽，终浓度分别为2、4、6 μ g/ml，以加 PBS为空白对照。在37°C、5% 〇)2浓度条件下培养48h后每孔加入50 μ I 2mg/mL MTT，37°C，5% 0)2继续培养4h，离心，去 上清，加入150 μ I DMSO微孔板震荡上震荡10分钟，使结晶物溶解，测定各孔OD57tl值。实 验设三复孔，取其平均值，并计算标准误差。
[0046] 3.重组制备方法的建立
[0047] 3. 1载体构建：
[0048] 人工合成该多肽核酸序列，借助PCR技术利用下面引物：
[0049] NOl-F ：CATATCGGTCTCGGCAGAGTGATGCCTGT (SEQ ID NO ：3)
[0050] BsaI
[0051] N01-R ：CCCAAGCTTTTTTGGGATTTGAGGGTCA(SEQ ID NO ：4)
[0052] HindIII
[0053] 扩增出含有上述酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回收产物双酶切后载入 pSUMO载体（Lifesensors，USA)，转入DH5a感受态细胞