抗Her1的治疗性抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种全人源的IgGl型抗体，该抗体与人表皮生长因子受体（EGFR或 Herl)的细胞外域的不同子区域结合。本发明进一步涉及该抗体抑制Herl表达的肿瘤细胞 增殖的方法。本发明还涉及这类抗体对于治疗各种恶性疾病的用途。
【背景技术】
[0002] Her家族与肿瘤的联系已经在文献中被广泛描述，这些受体通过同型或异型二聚 物的形式在激酶家族成员内形成信号复合物（Yarden and Sliwkowski, Nat Rev Mol Cell Biol. 2001，2: 127-37)。抗Her家族成员的药物能够抑制配体结合和受体的激活，经 由补体依赖的细胞毒作用（CDC)和抗体依赖的细胞毒作用（ADCC)诱导受体内化和向下调 节，增强受体降解来介导免疫系统应答（Ciardiello and Tortora, N Engl J Med. 2008， 358: 1160-74)。
[0003] Herl是一个已经被验证的肿瘤免疫治疗的^A(Mendelsohn, Endocr Relat Cancer. 2001，8: 3-9)。在目前的临床实践中，一个治疗策略就是针对受体的特异性抗体 的应用，包括西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗（Friedljinder et al.，Immunol Lett. 2008, 116: 126-40; Quatrale et al. , Front Biosci (Landmark Ed). 2011, 16: 1973-85)。尼妥珠单抗在临床上成功用于内皮源性肿瘤的治疗（Ramakrishnan et al., MAbs. 2009，1: 41-8)。众所周知，正如西妥昔单抗和帕尼单抗，尼妥珠单抗作用于Her 1 的细胞外子区域3 (D3)。
[0004] 最近的研宄显示，同时靶向Herl的非竞争性抗体会更加有效，应用两种抗D3的 抗体比单独应用一种抗体，使得具有配体自分泌功能的迀移和增殖细胞会在更大的程度 上被抑制。抗体的联合应用会增加受体的向下调节，不必激活下游的信号传导（Spangler et al·，Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107: 13252-7)。又一个近期在 II 期临床 试验中被应用的抗D3抗体连用的例子，就是Sym004 (Koefoed et al.，MAbs. 2011，3: 584-95)，能够协同抑制肿瘤细胞的生长。Sym004能够在体内和体外诱导小鼠异种移植模 型上的受体转移，等效或强效于西妥昔单抗或帕尼单抗（Pedersen et al.，Cancer Res. 2010，70: 588-97)。此外，这种联合应用显示了在西妥昔抵抗的细胞模型上体内和体外的 抗肿瘤活性（Iidaet al·，Neoplasia. 2013，15(10):1196-206)，同时增加了人肺和头 颈部细胞的辐射敏感性（Huang et al·，Mol Cancer Ther. 2013，12: 2772-81)。非竞 争性的抗D3抗体和西妥昔单抗或帕尼单抗都已经被鉴定出来。这种结合能够增强受体的 降解，抑制增殖和体外的三阴性乳腺癌细胞的异种移植生长（Ferraro et al.，Proc Natl Acad Sci U S A. 2013，110: 1815-20)。因此，研宄靶向于Herl细胞外域多个不同子区 域的新的单克隆抗体是提高EGFR靶点治疗概念的一个极具吸引力的课题。尤其是，到目前 为止，在临床上还没有靶向于D4子区域的抗体被评价。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于获得识别Herl细胞外子区域4(D4)的全人源单克隆抗体。 本发明的另一个主要目的是应用这类单克隆抗体治疗Herl表达的肿瘤。
[0006] 相应地，本发明涉及从合成的全人源噬菌体抗体库中挑选结合重组Herl细胞外 子区域3-4 (D3D4)的全人源单克隆抗体；这些抗体在抑制Herl表达的肿瘤细胞的增殖和 诱导细胞死亡中的用途；这些抗体和其他抑制Herl细胞外子区域D3的抗体在治疗一些恶 性疾病中的联合使用。
[0007] 本发明的技术方案如下： 本发明同时提供了一种能够结合人Herl细胞外子区域D4的全人源单克隆抗体，该抗 体能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞的死亡，所述抗体包含重链可变区和轻链可变 区，其重链可变区依次包含高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3,所述⑶Rl的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 1，17所示；所述CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 2,18所示；所述CDR3的氨基 酸序列分别如SEQ ID NO 3,19所示； 其轻链可变区依次包含高变区⑶Rl' XDR2'和⑶R3'，所述⑶R1'的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO 4, 20所示；所述CDR2'的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 5, 21所示；所述CDR3' 的氨基酸序列分别如SEQ ID NO 6, 22所示。
[0008] 其重链框架区序列分别如SEQ ID NO 7-10, 23-26所示，其轻链框架区序列如SEQ ID NO 11-14, 27-30 所示。
[0009] 其重链核苷酸序列分别如序列15,31所示，轻链核苷酸序列分别如序列16,32所 不O
[0010] 本发明同时提供了一种单克隆抗体，能够识别Herl E⑶和D3D4,但不能单独识别 D1D2 或 D3。
[0011] 本发明提供的全人源单克隆抗体，所述的抗体能够导致体外抑制肿瘤细胞增殖并 诱导细胞死亡的活性。
[0012] 本发明同时提供了所述的全人源单克隆抗体的筛选方法，该筛选方法包含下面的 步骤： (1) 获得合成的人噬菌体展示Fab片段库； (2) 筛选：应用重组Herl细胞外子区域D3D4从人抗体库中筛选； (3) 评价结合特性：应用Herl细胞外域E⑶和子区域D1D2，D3和D3D4来评价选中的 特异性抗体的结合特性； (4) 评价Herl过表达的肿瘤细胞系的抗增殖和诱导细胞死亡的效果。
[0013] 本发明提供了所述的全人源单克隆抗体用于制备治疗EGFR过表达的恶性疾病的 药物中的用途。
[0014] 其中所述的药物为一种治疗性抗体联合应用靶向于Her 1子区域D3的另一种治 疗性抗体。
[0015] 其中所述的一种治疗性抗体是如上所述的抗体，所述的另一种治疗性抗体是尼妥 珠单抗。
[0016] 本发明的另一个优选的实施例是关于Dl和El抗体在Herl表达的肿瘤细胞中对 于抑制增殖和诱导细胞死亡的能力的实验。
【附图说明】
[0017] 图1 :合成的scFv模板基因 （VH-linker-Vlambda)，用于构建抗体库。两侧是限制 性酶切位点ApaLI和NotI，在每个⑶R3区包含连续3个终止密码子。
[0018] 图2 :在pHAB噬菌粒内基于scFv模板基因的基因构建。
[0019] 图3 :反义诱变寡核苷酸，用于增加库中CDR3序列中VH (A-C) and Vl (D-E)的 多样性。
[0020] 图4a :pTSE质粒载体图。
[0021] 图4b :组氨酸标记的Herl细胞外子区域I-II (D1D2)和III-IV (D3D4)的表达。 Herl的细胞外域应用亲和色谱柱纯化（Le0n et al·，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009， 877: 3105-10)。
[0022] 图4c :尼妥珠单抗对重组Herl细胞外域和它的子区域的结合。抗人⑶6抗体Tlh 用作阴性对照（Roque-Navarro et al·，Hybrid Hybridomics. 2003，22: 245-57)。
[0023] 图4d :D1和El抗体对于重组Herl细胞外域的D3D4的结合。
[0024] 图5a :单生物素化的重组Herl细胞外域D1D2，D3和D3D4的表达。
[0025] 图5b :尼妥珠单抗hR3、Dl和El对重组Herl细胞外域和它的子区域的结合。
[0026] 图5c :D1和El抗体的亲和力。
[0027] 图6 :D1和El抗体在Herl过表达的肿瘤细胞系中抑制细胞增殖的能力。
[0028] 相应序列的简要说明 SEQ ID NO 1-3 :D1重链可变区的高变区的氨基酸序列； SEQ ID NO 4-6 :D1轻链可变区的高变区的氨基酸序列； SEQ ID NO 7-10 :D1重链框架区的氨基酸序列； SEQ ID NO 11-14 :D1轻链框架区的氨基酸序列； SEQ ID NO 15 :D1重链可变区的核苷酸序列； SEQ ID NO 16 :D1轻链可变区的核苷酸序列； SEQ ID NO 17-19 :E1重链可变区的高变区的氨基酸序列； SEQ ID NO 20-22 :E1轻链可变区的高变区的氨基酸序列； SEQ ID NO 23-26 :E1重链框架区的氨基酸序列； SEQ ID NO 27-30 :E1轻链框架区的氨基酸序列； SEQ ID NO 31 :E1重链可变区的核苷酸序列； SEQ ID NO 32 :E1轻链可变区的核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0029] 下面的实施例是用于证实本发明但不仅限于它的范围。现有技术方法的详细描述 暂未提供。
[0030] 实施例1:抗重组Herl D3D4的全人源合成噬菌体展示scFv抗体库的构建和淘选 根据已经建立好的程序（Fellouse and Sidhu, in Making and using antibodies, CRC Press. 2007，157-177)，通过大规模的 Kunkel 突变法（1(11111?51，？1'〇(3.恥七1.六。&(1· Sci. USA. 1985，82: 488-492)来构建合成scFv抗体库。库的模板基因（图I)是基于 通过微基音编码连接肽，两侧是限制性酶切位点（Chaudhary et al.，Proc. Natl. Acad. Sc