一种培养mdck细胞增殖重组h5n1亚型禽流感病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种增殖禽流感病毒的方法，尤其是一种纸片载体生物反应器规模化培养MDCK细胞增殖禽流感病毒的方法。
【背景技术】
[0002]禽流感(Avian influenza, Al)是由A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为A类传染病，我国也将之列为一类动物疾病。目前，疫苗免疫是国内外防治禽流感暴发的主要措施，我国目前大多数厂家以SPF鸡胚为基质生产禽流感疫苗，该工艺对SPF鸡胚有很大的依赖性；所产出的病毒液滴度不高；培养过程中条件不够均一，批间差异较大；由于鸡胚污染情况不可避免，致使疫苗内内毒素偏高，对免疫效果造成很大影响；同时鸡胚生产造成大量的鸡胚废弃物，对生态环境也是很大污染。
[0003]在生物反应器中用载体大规模培养动物细胞增殖禽流感病毒，已成为一种新的生产方式被推广应用，但目前多数厂家采用微载体进行病毒增殖，微载体多为美国GE公司生产，成本很高，同时由于每单位培养液中微载体的添加量限制，致使单位体积内细胞密度不高，从而无法获得高效价的抗原。而该工艺的发明不仅可以克服用鸡胚生产的弊端，同时又改变了生物反应器对微载体的依赖，使载体成本大大降低，最终获得高效价抗原液，进一步降低生产成本，对整个禽流感疫苗传统生产工艺有革命性的创新。
【发明内容】
[0004]为了解决用转瓶培养动物细胞增殖禽流感病毒过程中存在的问题，本发明提供了一种纸片载体生物反应器大规模培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的工艺方法。本发明所述的方法，可显著提高禽流感病毒液的滴度，减小批次间质量差异，减小染菌几率，控制内毒素含量，且该方法易于扩大生产规模，进行集约化生产，可用于显著提高疫苗的产量和质量。
[0005]本发明提供一种纸片载体生物反应器大规模培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法，其包括以下具体步骤:
[0006]I)片状载体的准备:所述片状载体可以为a)将聚酯纤维纸片载体通过剪裁，做成长10cm，宽2cm的波浪形；b)将纸片载体通过剪裁，做成长10cm、宽2cm的长条形；c)将纸片载体通过剪裁，做成直径2cm的圆形中的一种或几种。
[0007]2)纸片载体预处理:将步骤I)得到的纸片载体用0.5mol/L-l.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡12-36h，然后用注射用水清洗至pH为7.2-7.6，放掉注射用水，加入PBS液浸泡保存。
[0008]3)生物反应器灭菌及预培养:将经过步骤2)处理的纸片载体按照15_30g/L的使用量加入生物反应器内，加入浸没纸片载体的PBS液，连接生物反应器所有管路后进行在线蒸汽灭菌:12rC，30min，灭菌完成后加入细胞培养液进行预培养12_24h。
[0009]4)细胞接种及在纸片上的吸附:反应器预培养无异常后，将细胞密度为I X 106-2X107cells/g纸片载体的细胞悬液通过无菌管道加入生物反应器内，调节电机转速为20-40rpm，有利于细胞贴附于纸片载体上。同时调节培养参数为:pH7.0-7.4、温度37±0.2°C、D050% -80%，细胞在纸片载体上的贴附时间为3_6h。
[0010]5)细胞扩增培养:步骤4)的细胞在纸片载体贴附后进入正常连续培养状态，调整反应器培养参数为:转速60-90rpm、温度37±0.2°C、pH7.0-7.4、D0 30%-70%。因为纸片载体的表面积较大，扩增培养过程中，细胞数量会呈数量级倍增，所以培养过程中需要不定时取样，测定细胞生长液中的残葡萄糖浓度，计算细胞生长过程中的耗糖速率，根据细胞的耗糖速率来计算细胞的生长状况，及时补加葡萄糖或更换新鲜培养液。
[0011]6)禽流感病毒接种与繁殖:待步骤5)的细胞密度达到要求后，放掉反应器内的细胞培养液，通过无菌管道加入禽流感病毒接种液和无血清维持液，调整反应器培养参数为:转速60-90rpm、温度35°C -37°C、pH7.0-7.4,DO 30% -70%，进行病毒增殖培养。接种量按照总工作体积的1% -2%接种。
[0012]7)病毒液收获:待步骤6)接种禽流感病毒12h后，每隔6h取样，测定病毒液的HA效价，待其HA效价达到所需后收获，经检测合格后作为制苗抗原液使用。
[0013]本发明方法所得的禽流感病毒液HA滴度多1:1024。
[0014]所述纸片载体为聚酯纤维类纸片载体。
[0015]其中，种子细胞的供应为:用转瓶扩增培养MDCK-α -2，3Gal细胞，挑选形态健康、生长良好的细胞用胰酶消化制成细胞悬液，并进行细胞计数，作为纸片载体生物反应器的种子细胞。
[0016]本发明的有益效果为:
[0017]本发明在生物反应器中用纸片载体大规模培养动物细胞增殖禽流感病毒，细胞扩增较快，单位体积内细胞数量大，产出病毒液滴度较高；培养过程中的参数可监控，整个培养过程条件均一，使细胞时刻处于最佳生长状态，批间差异小；同时由于生物反应器各连接管道均为密闭管道，染菌的几率小，易于控制产品的质量，大大提高了产品的适产、适用性和生物安全性。
【具体实施方式】
[0018]下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
[0019]实施例1
[0020]一种培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法，其包括以下步骤:
[0021]种子细胞供应:用7升微载体生物反应器扩增培养MDCK- α -2，3Gal细胞，挑选形态健康、生长良好的细胞用胰酶消化制成细胞悬液，并进行细胞计数，作为纸片载体生物反应器的种子细胞。
[0022]I)片状载体的制备:将聚酯纤维纸片载体通过剪裁为长10cm，宽2cm的波浪形纸片。
[0023]2)纸片载体预处理:步骤I)得到的片状载体用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡16h，然后用注射用水清洗至pH为7.6，放掉注射用水后，加入PBS液浸泡待用。
[0024]3)生物反应器灭菌及预培养:将经过步骤2)处理的纸片载体加入生物反应器内，再加入新鲜的能浸没纸片载体的PBS液，安装好反应器并连接好所有管路后进行在线蒸汽灭菌，灭菌设置为121°C，25min。灭菌完成，待反应器罐体温度降到40°C以下后通过放料阀放掉PBS液，通过进料阀加入细胞培养液进行预培养，设置预培养温度为35°C，培养时间为20ho
[0025]4)细胞接种及在纸片上的吸附:反应器预培养后取样检测培养液，确定无异常后，将计数为1.6 X 107个cel ls/g纸片载体的种子细胞通过无菌管道加入生物反应器内，调节电机转速为20rpm，有利于细胞贴附于纸片载体上。同时打开反应器所有条件控制，调节培养参数为:pH7.2、温度37±0.2°C、DO 60%。
[0026]5)细胞扩增培养:低转速下待步骤4)的细胞在纸片载体上贴附3h后，进入正常连续培养状态，调整反应器培养参数为:转速60rpm、温度37±0.2°C、pH7.2、DO