鱿鱼碎肉制备高f值寡肽固定化酶水解方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高F值的肽水解方法，尤其涉及鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化 酶水解方法。
【背景技术】
[0002] 鱿鱼（Squid)属软体动物门头足纲，具有较显著的品种特征：个体大，胴体长，肉 质嫩而多汁。鱿鱼肉质风味近似鲍鱼，价格低廉，可食部分近80%。在我国鱿鱼的大规模 捕获和加工是近十多年来才发展起来的，随着我国北太平洋鱿钓业规模形成，鱿鱼产量不 断扩大。据FA0渔业统计年检报道，1998年我国鱿鱼年捕获量达2314万吨，约占世界总量 (260万吨)的9%。但是鱿鱼精深加工技术匮乏，在处理过程会有碎肉等副产物产生，但主要 作为鱼粉或饲料的低值粗放利用，不仅原料利用效率低下，而且污染环境。因此鱿鱼碎肉的 高值绿色开发不仅能够提高现有资源的利用效率、提升经济效益、保护环境，也为增加水产 加工的附加值提供了新的方向。 高F值寡肽（F值> 20)是由3?9个氨基酸残基所组成的小肽混合物，F值是指混合 物中支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，简称BCAA)与芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨 酸和酪氨酸，简称AAA)的物质的量比值，是为了纪念德国著名学者Fischer在20世纪70 年代提出的"伪神经传递质假说"而命名的。高F值寡肽为小分子短肽，与游离氨基酸相比 具有渗透压低、抗原性低等优点，所以更容易被吸收，可以作为运动员的营养补充剂，帮助 术后病人复原。更有研究表明高F值寡肽产品在肝脏保护、肝性脑病以及苯丙酮尿症治疗 等方面具有显著功效，而且不断被应用于新的技术领域。已有文献表明制备高F值寡肽选 用的原料主要是一些植物性蛋白和乳源性蛋白，利用水产品作为原料制备高F值寡肽除本 课题组外未见报道。
[0003] 高F值寡肽制备通常有直接提取法、化学合成法、酸碱水解法以及生物酶解法。直 接提取分离法是采用利用各种分离纯化技术，从生物体中直接提取其体内所固有的生物活 性肽，但由于天然生物体中活性肽的含量很低，故要想获得高纯度的活性肽是需要多次分 离的，造成制备成本高，工艺复杂，难以产业化。化学合成法是利用已知的活性肽序列，将氨 基酸片段脱水缩合得到所需活性肽。但是在合成过程中为了避免副反应的发生破坏肽活性 侧链，需用大量的化学试剂对侧链进行保护，因此该法难以用于实际生产。酸碱水解法的原 理是蛋白质在酸性或碱性条件下能够被水解成肽和氨基酸。此法虽然工艺简单成本低，但 反应条件剧烈，对蛋白质空间结构改变严重，氨基酸受损厉害，甚至产生有毒物质，故实际 应用中较少采用。酶解法因反应过程容易控制、反应条件温和，且水解过程中并不添加化学 试剂等特点而被实际生产所采用。酶（enzyme)是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性 的物质，它具有高效性、专一性、温和性、活性可调节等特点，在生产中得到广泛的应用。但 是由于酶具有易变性，酸碱盐等不利条件易使蛋白质的四级结构乃至三级结构发生变化， 从而降低甚至丧失生物活性。实际生产中酶多数以游离态存在，难以实现酶的回收利用，造 成成本高、效率低的局面，因此难以实现工业的连续化和全自动化的发展。酶的固定化是用 固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能发挥其特有的催化作用，并可回收重复使用 的技术。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术提供一种原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风 味好、F值高、水解度高的鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化 酶水解方法，包括如下步骤： ① 固定化胃蛋白酶制备步骤：取壳聚糖粉末溶解于质量分数为〇. 1%至8%的HAc溶液， 并且搅拌1小时至5小时后得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到固定化液浸泡后低温静 置；再将静置处理后的固定化液干燥处理，并收集微球；将微球放入乳酸缓冲溶液中混合 均匀待用；固定化液含有NaOH和酒精； ② 固定化风味酶制备步骤：取风味酶粉溶解于〇. 〇2mol/L，pH7. 0的磷酸盐缓冲溶液制 成酶液；将酶液加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀；注射器吸入上述混合液，注入3. 0% 的CaCi2溶液中得到凝胶珠，并在继续&(^2溶液中固定化；将凝胶珠抽滤后得到硬化的 凝胶珠，洗去表面的，即得到球状固定化风味酶； ③ 动态串联酶处理步骤：按重量份数取10至50份鱿鱼碎肉加入100至250份水制成 匀楽，调pH至3,加入步骤①处理制得的微球，在45至55°C条件下恒温水解1至5小时后 制得第一步酶解多肽液；在第一步酶解多肽液中按每克加入1〇〇〇至1900U的球状固定化风 味酶进行第二步酶解； ④ 吸附脱芳处理步骤：将步骤③处理得到的第二步酶解的产物在pH为3,流速为lBV/h 进行脱芳处理后得到高F值寡肽。本发明的动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具 有很大的创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高 值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值 寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到 品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物，采 用的风味蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。因 此本法制备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的特点，为水产 加工副广物的_值利用提供了 一种新的思路。
[0006] 为优化上述技术方案，采取的措施还包括如下步骤： ① 固定化胃蛋白酶制备步骤：取壳聚糖粉末溶解于质量分数为0. 1%至8%的HAc溶液， 并且搅拌1小时至5小时后得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到固定化液浸泡后低温静 置；再将静置处理后的固定化液干燥处理，并收集微球；将微球放入乳酸缓冲溶液中混合 均匀待用；固定化液含有NaOH和酒精； ② 固定化风味酶制备步骤：取风味酶粉溶解于〇. 〇2mol/L，pH7. 0的磷酸盐缓冲溶液制 成酶液；将酶液加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀；注射器吸入上述混合液，注入3. 0% 的溶液中得到凝胶珠，并在继续^^^^溶液中固定化；将凝胶珠抽滤后得到硬化的 凝胶珠，洗去表面的c?a2，即得到球状固定化风味酶； ③ 动态串联酶处理步骤：按重量份数取10至50份鱿鱼碎肉加入100至250份水制成 匀楽，调pH至3,加入步骤①处理制得的微球，在45至55°C条件下恒温水解1至5小时后 制得第一步酶解多肽液；在第一步酶解多肽液中按每克加入1〇〇〇至1900U的球状固定化风 味酶进行第二步酶解； ④ 吸附脱芳处理步骤：将步骤③处理得到的第二步酶解的产物在pH为3,流速为1BV/ h进行脱芳处理后得到高F值寡肽。本发明的动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道， 具有很大的创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了 高值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F 值寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得 到品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物， 采用的风味蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。 因此本法制备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的特点，为水 产加工副产物的高值利用提供了一种新的思路。步骤①中搅拌温度为20°C至30°C;步骤① 中，固定化液按体积份数含有4份10%Na0H、l份95%酒精。步骤①中乳酸缓冲溶液按体积 份数含有2至4份浓度为5%的戊二醛、5至10份胃蛋白酶液和6至8份乳酸。步骤①中乳 酸缓冲溶液中混合的处理温度为35°C。步骤②中海藻酸钠溶液的浓度为2. 5%，酶液体积/ 海藻酸钠体积为1:2, €^02溶液中固定化的时间为3小时。步骤③中第二次酶解的处理温 度是40至55°C，pH为7,处理时间为3至5小时。采用上述温度，能在达到较好效果的同 时，最大程度的节省能源。
[0007] 由于本发明采用了固定化胃蛋白酶制备步骤、固定化风味酶制备步骤、动态串联 酶处理步骤、吸附脱芳处理步骤，其动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具有很大的 创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高值化利用， 而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值寡肽的原 料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到品质较好 的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物，采用的风味 蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。因此本法制 备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的