一种gRNA体外合成及活性检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，涉及基因编辑相关的一种gRNA体外合成及活性检测 的方法。
【背景技术】
[0002] 基因定点敲除技术通过对染色体上基因特异位点进行定点突变，使其功能丧失， 进而达到研宄其功能的目的。一些利用基因敲除技术创建的疾病动物模型对医学研宄的发 展做出了重要贡献。传统的基因敲除技术于上世纪80年代末由Smithies等创立，通过同 源重组手段将构建的外源DNA片段插入并替换相应染色体上特定的区段，达到基因敲除的 目的。这一技术的应用使人类能够有目的地研宄基因功能和与之相关的疾病之间的直接关 系。然而由于同源重组技术需要载体构建、ES细胞打靶、筛选、显微注射、小鼠鉴定等一系 列较为复杂的操作步骤，并且成本较高、周期较长，大大限制了这一技术的应用。针对同源 重组的缺点，科学家一直在探索用其它更简便的技术来实现基因敲除。先后发明了ENU随 机突变、基因捕获、ES细胞基因敲除细胞库等方法和手段，但由于技术手段和操作成本的限 制，这些技术都不能完全替代传统的同源重组技术。2009年以后出现了一系列新的基因编 辑技术，包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9,开创了基因敲除（敲入）新的时代。这些新基因 编辑技术作用原理相似，即通过核酸酶在目的基因的DNA双链上制造切口，然后利用生物 体自身的修复机制以同源重组或者非同源末端连接的方式实现修复，进而达到基因失活的 目的。作为一种最新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是通过gRNA(又称引导RNA，真核 生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA)识别特异的靶序列，同时引导Cas9 核酸酶在DNA的特异位点上制造切口，然后利用生物体自身的修复机制进行DNA修复。这 一过程中可能造成碱基改变，增加，缺失等突变现象，进而实现对目的基因的敲除与修饰。
[0003] CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑功能已被成功应用于多种生物，包括人类细 胞、斑马鱼、小鼠、大鼠、植物及细菌。众所周知，生物体的一个性状往往由多个基因共同决 定。传统的基因敲除费时费力却只能每次敲除一个相关基因，而CRISPR/Cas9系统其中一 个最重要的特点便是可在多个不同gRNA的引导下由Cas9核酸酶一次靶向敲除多个基因组 位点。与其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有其独特的优势：
[0004] 1、其RNA-DNA识别机制，避免了DNA甲基化造成的影响。
[0005] 2、与ZFN和TALEN相比，它有相同或更高的基因编辑效率，尤其在点突变方面优于ZFN或TALEN。
[0006] 3、设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶表达载体，适用于任何分子生物学实 验室。
[0007] 当前基因编辑技术迅速发展，CRISPR/Cas9技术以其优势将迅速推动基因组功能 的研宄。快速获取目标gRNA并检测验证其活性将会为科学实验赢得宝贵的时间，并进一步 推动这项技术的应用。常规获取gRNA要构建表达载体，需要把gRNA的转录模板连接到载 体上，经过涂板、挑选单克隆、摇菌、提取质粒、测序验证，最终还要酶切使质粒线性化才能 得到gRNA的体外转录模板，得到gRNA最少也需要3天的时间。本发明旨在迅速获取gRNA的体外转录模板，并在转录后通过体外实验验证其活性及特异性。为后续转染或显微注射 筛选有效的gRNA节省了宝贵的时间。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供体外合成目标基因的特异gRNA的方法。
[0009] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0010] 1)合成gRNA转录模板的上游引物（单链DNA)、gRNA转录模板的下游引物（单链 DNA)和gRNA保守片段（双链DNA);
[0011] 所述gRNA保守片段的核苷酸序列为序列表中序列2 ;
[0012] 所述gRNA转录模板的上游引物从Y 方向为17启动子部分片段、gRNA前 导片段和核心区域；
[0013] 所述17启动子部分片段的核苷酸序列为序列表中序列3自5'末端第1-20位； [0014] 所述前导片段为目标基因的基因组DNA中位于PAM片段上游的20个核苷酸；所述 PAM片段为NGG，其中，N为A、T、C、G中任一个；
[0015] 所述核心区域的核苷酸序列为序列2自5'末端第1-13位，其为gRNA保守片段序 列中自5'末端第1-13位的核苷酸组成的DNA分子；
[0016] 所述下游引物的核苷酸序列为序列表中序列4 ;
[0017] 2)以所述gRNA保守片段为模板，用所述gRNA转录模板的上游引物和所述gRNA转 录模板的下游引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为gRNA转录模板；
[0018] 3)将所述gRNA转录模板进行体外转录得到gRNA，即为目标基因的特异gRNA。
[0019] 上述方法中，
[0020] 所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3 ;
[0021] 所述PAM片段为GGG;
[0022] 所述上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
[0023] 上述方法中，
[0024] 在所述步骤3)后还包括步骤4):体外检测所述特异gRNA活性的步骤；
[0025] 所述体外检测所述特异gRNA活性的方法包括如下步骤：将含有gRNA靶片段的 DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开， 且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小 一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所 述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，则所述特异gRNA无活性 或无特异性；
[0026] 所述DNA分子中的gRNA靶片段既不在所述部分片段的正中央，也不在所述部分片 段的起始或者末端。这样选择的原因是为了避开剪切后，两条片段不能分开或者虽然可以 分开但一条带过小不易观察，具体所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA 靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
[0027] gRNA靶片段上游片段为在基因组中gRNA靶片段的上游片段；
[0028] gRNA靶片段下游片段为在基因组中gRNA靶片段的下游片段。
[0029] 上述方法中，所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3 ;
[0030] 所述DNA分子为包含NKp46基因外显子Exon3的部分片段，其核苷酸序列为序列 表中序列8 ;
[0031] 所述NKp46基因外显子Exon3的gRNA转录模板的上游引物的核苷酸序列为序列 表中序列3。
[0032] 上述方法中，
[0033] 所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3 ;
[0034] 所述NKp46基因外显子Exon3的gRNA转录模板的上游引物的核苷酸序列为序列 表中序列3。
[0035] 由上述的方法制备的gRNA也是本发明保护的范围，本发明以NKp46基因外显子 Exon3的gRNA为例，但不仅限于该基因的该gRNA的合成与检测，利用该方法设计合成及检 测的所有gRNA都是本发明的保护范围。实施例为序列5所示的DNA分子转录得到的RNA。
[0036] 上述的gRNA在酶切目的基因中的应用也是本发明保护的范围。
[0037] 本发明的另一个目的是提供一种体外检测上述的特异gRNA活性的方法。
[0038] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0039] 将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切 产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶 片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开 或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不 一致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
[0040] 所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一 致，且均不为0。
[0041] 上述方法中，所述DNA分子为包含NKp46基因外显子Exon3的部分片段，其核苷酸 序列为序列表中序列8。
[0042] 所述gRNA靶片段上游片段大小为804bp;
[0043] 所述gRNA靶片段下游片段大小为493bp。
[0044] 本发明的第三个目的是提供成套DNA。
[0045] 本发明提供的成套DNA，包括上述的gRNA转录模板的上游引物，上述的gRNA转录 模