一种基于磁珠与多糖水解分离发光标记物的核酸检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化检测和分子诊断领域，尤其涉及一种基于磁珠与多糖水解分离发光标记物的核酸检测方法。本发明可应用于涉及超灵敏核酸分子检测的领域。
【背景技术】
[0002]近年来，由于恶性公共卫生事件频发，如1996年日本发生的大肠杆菌(E.coli)0157:H7食物中毒的暴发流行，引起数人死亡，超过万人感染，造成巨大的社会恐慌；2003年SARS病毒在我国的肆虐；2005年猪链球菌的危害；近来禽流感病毒及2009年全世界范围内流行的甲型HlNl流感病毒等，都对人们的健康和生命造成了严重的威胁。另外，致病微生物污染也是影响我国食品卫生和安全的最主要因素，微生物性食物中毒导致的中毒人数最多，在2003年和2004年全国报告的重大食物中毒事故中，微生物性重大食物中毒起数和人数均有增加，分别占当年总起数和总人数的26%、43.8%和34%、58.1 %。食品在加工、运输、贮藏、销售等过程中极易受到致病微生物污染。有害致病微生物不仅影响人们的健康，危及人们的生命，而且引起全社会的恐慌，影响正常的社会运行。为了能快速准确地鉴定病原体，力求将病原体对人的危害降到最低，科学家们使用了很多种鉴定方法。传统的微生物特征信息检测方法有病原体的培养、生化分析、毒素测定、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些检测方法不仅不适合快速侦检，而且难以检测和鉴定病原体中所含的多种信息，如致病基因、毒力基因、抗性基因等。虽然近年来也发展了 PCR技术及核酸探针杂交技术，但不能对微生物特征信息进行快速检测、更不具备高通量筛查的能力。
[0003]恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。世界卫生组织和国际抗癌联盟的相关资料显示，如果不能有效控制恶性肿瘤的发病率，预计癌症发病例在2020年将达到1600万，近1000万人死亡。我国每年新增癌症患者约160万人，其中因癌症死亡人数约130万人。导致癌症患者死亡主要是因为无法及早发现从而贻误治疗时机以及肿瘤治愈率低，而早期发现与有效治疗是预防和治疗癌症的关键手段。几十年来，研宄者们发现，生物标志物可以用来进行肿瘤早期诊断，使得癌症的治愈率、生存率大大提高。近年来，随着微小RNA(microRNA, miRNA)的发现和进一步研宄，使其有可能作为新的生物标志物。已证实，miRNA在外周血中的表达具有肿瘤相关性、组织特异性以及表达稳定性，外周血miRNA很可能是一种理想的肿瘤标志物，为癌症的早期诊断开辟了新途径。目前，外周血miRNA的检测手段主要有miRNA芯片技术与实时荧光定量PCR技术。但二维的芯片技术使得核酸杂交效率低下，使得其检测灵敏度相对偏低。而荧光定量PCR检测miRNA需要设计复杂的茎环探针，以及进行扩增反应，使得其检测成较高，亦无法实现自动化。
[0004]随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，纳米磁珠(magnetic beads, MBs)因具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易功能化、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已应用于细胞分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及核酸检测等方面。
[0005]近年来，发光标记类检测方法，如荧光标记、酶标化学发光等已广泛应用于生物分子检测来放大检测信号以提高检测灵敏度。操作安全，方法简便、快速，具有巨大的潜力，正成为生物分析研宄与发展的最重要领域。因此，结合核酸探针杂交技术，通过标记能够产生发光信号的分子而获取靶核酸信息，可实现靶核酸的快速检测与高通量筛查。
[0006]目前，已报道各种基于固相杂交与发光标记的核酸检测方法。其基本思路为:在固相载体表面修饰核酸探针，通过捕获标记有发光信号分子的待测特异核酸片段，再检测发光信号，经分析后，即可快速确认靶核酸的特性。
[0007]但随着研宄深入发现，影响基于磁珠与发光标记核酸检测方法灵敏度的一个重要因素为:发光信号会由于磁珠的遮蔽作用而大大减弱一一灵敏度降低最高可达90%。但现有技术仅有荧光检测法采用高温使双链核酸变性解链的方法分离荧光标记物，因为荧光标记物如荧光素(Cy3，Cy5)等可耐受高温。但化学发光检测法等的发光标记物无法通过高温的方式达到此目的，因为化学发光标记物等无法耐受高温，当高温时会失活而无法继续进行发光检测。因此，研制出一种通用的基于磁珠与分离发光标记物的核酸检测方法，能够极大地提高荧光、尤其是化学发光的检测灵敏度，这对于疾病分子诊断、食品微生物监测等具有重大意义。
【发明内容】
[0008]技术问题:本发明所要解决的主要技术问题是克服现有的基于磁珠与发光标记物的核酸检测方法存在的检测灵敏度受限问题，其原因是磁珠对光信号产生遮蔽效应，极大地减弱了发光信号强度。因此，提出一种基于磁珠与多糖水解分离发光标记物的核酸检测方法。
[0009]技术方案:本发明的一种基于磁珠与多糖水解分离发光标记物的核酸检测方法包括:
[0010]I)在磁珠表面修饰适合连接核酸探针的多糖分子；
[0011]2)设计用于检测靶核酸片段的功能化探针，将功能化探针修饰于结合有多糖分子的磁珠表面；
[0012]3)通过杂交，将靶核酸片段及其发光标记物捕获至磁珠表面；
[0013]4)磁分离，清洗，即得到已获取发光标记物的磁珠；
[0014]5)加入多糖水解试剂，通过多糖水解将发光标记物从磁珠表面分离下来，即得到不含磁珠的发光标记物溶液；
[0015]6)对该发光标记物溶液进行发光检测，即可获取靶核酸信息。
[0016]其中:
[0017]步骤I)所述表面修饰包括但不限于在磁珠表面以共价键、非共价键或物理吸附方式修饰功多糖分子。所述多糖分子是能够同时与磁珠及功能化探针以共价键、非共价键或物理吸附的方式结合的多糖。
[0018]多糖包括葡聚糖、壳聚糖、纤维素或聚乙二醇及其衍生物。
[0019]步骤2)所述靶核酸片段为非扩增或经扩增后的核酸片段。所述功能化探针为能够与多糖分子共价结合或物理吸附，并与靶核酸片段序列互补的寡核苷酸。
[0020]步骤3)所述发光标记物为适用于分子检测的能够产生发光信号的分子，包括荧光标记物如荧光素Cy3或Cy5，化学发光标记物如碱性磷酸酶及其化学发光底物、辣根过氧化物酶及其化学发光底物。所述发光标记物，其标记靶核酸的方式包括通过靶核酸扩增进行标记、通过报告探针与靶核酸片段杂交进行标记。
[0021]步骤5)所述多糖水解试剂为能够水解多糖的化学或生物试剂，包括多糖水解酶如葡聚糖酶、壳聚糖酶或纤维素酶。
[0022]步骤6)所述发光检测为基于分子标记的发光检测体系，包括荧光、化学发光或其他波长的光。
[0023]有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下特点:
[0024]多糖作为分子手臂将功能化探针连接于磁珠表面，提高了颗粒悬浮性、减小了空间位阻、增加了探针结合位点以及增加了杂交自由度，从而提高了杂交效率。将对应靶核酸片段的发光标记物从磁珠表面分离下来进行检测，避免了磁珠遮蔽效应，提高了发光信号强度。因此，本发明技术极大地提高了检测灵敏度。
【附图说明】
[0025]以下结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
[0026]图1为一种基于葡聚糖修饰磁珠与葡聚糖水解分离发光标记物的核酸检测方法流程示意图。
[0027]图2为HBV核酸PCR扩增产物电泳图。
[0028]图3为HBV核酸的化学发光检测动力曲线。
【具体实施方式】
[0029]本发明公布了一种利用磁珠易于磁分离的特性结合杂交以及多糖水解分离发光标记物的策略，对不含磁珠的发光标记物溶液进行发光检测，获取靶核酸信息的方法。在本发明的一个较佳的实例中，以Fe3O4OS12磁珠作为载体，在其表面修饰多糖分子，连接上功能化探针，以生物素标记靶核酸片段，通过核酸杂交将带生物素标记的靶核酸片段捕获至磁珠表面，通过与亲和素标记酶孵育使磁珠获取对应靶核酸片段的酶分子，然后利用葡聚糖酶水解葡聚糖将对应靶核酸片段的酶分子从磁珠表面分离下来，最后进行化学发光检测，获取靶核酸信息。其步骤如下:
[0030]1.在磁珠表面修饰多糖分子: