用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于传感器领域，具体涉及用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器。
【背景技术】
[0002]近年来，随着分子生物学等新技术的发展，在肿瘤疾病的研宄中，肿瘤标记物的检测已受到许多学者的关注。肿瘤标记物是指肿瘤发生及其增殖过程中由肿瘤细胞合成的、释放或宿主细胞对肿瘤反应而产生的一类物质，常以抗原、酶、激素等代谢产物的形式存在。已有研宄发现，乳腺癌的发生和进展过程与血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)有着密切的联系，通过检测它的水平对乳腺癌的监测、判断预后、治疗等有重要的意义。血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的调节血管生成的因子，由于肿瘤在生长增殖过程中，促进大量新生血管的形成，由于这些新生血管具有管壁薄和基底膜不完整等生理特点，为肿瘤的浸润和转移提供了基础条件，因此VEGF在肿瘤血管的形成、生长、转移过程中有着重要的作用，是重要的乳腺癌肿瘤标记物之一。常用的检测方法是酶联免疫法，但是这种方法存在着具有成本高，操作繁琐等缺点，因此有必要寻找一种更加准确、灵敏、经济、简便、无创的检测新技术来检测这一肿瘤标记物。
[0003]核酸适体(aptamer)是通过一种指数富集配体系统进化技术(SELEX)经体外筛选所到的寡聚核苷酸，它是一种单链的DNA或RNA，具有类似于抗体的功能，能识别特异性的靶分子，例如蛋白质、小分子、甚至整个细胞等。由于核酸适体具有分子量小、易于修饰和标记、化学稳定性、靶标分子范围广好等优点，科研工作者们开始对基于核酸适体的生物传感器进行了大量的研宄，发现它在生物医学领域的研宄和临床诊断显示出很好的应用前景。特别是Ronit Freemand等人筛选出VEGF的核酸适体并将其应用在生物传感器的研制上，为肿癌标记物VEGF高灵敏度检测提供了一种新的思路。
[0004]下面所述的为本发明人率先将具有简便、灵敏、经济等优点的荧光生物传感器用于快速检测乳腺癌中血管内皮生长因子，并设计出一种测定乳腺癌蛋白的荧光生物传感器:当靶分子VEGF不存在时，DNA探针与银离子结合形成发夹结构，碳化氮纳米材料的荧光信号不受影响；当靶分子VEGF存在时，DNA探针与VEGF结合形成G-四链体结构，探针的发夹结构被打开，银离子释放出来，猝灭碳化氮纳米材料的荧光信号。通过DNA探针对VEGF的识别作用，从而建立了高灵敏度、高特异性的乳腺癌蛋白检测方法，有望应用于乳腺癌的早期诊断及筛选抗肿瘤新药工作中，因而本发明具有巨大的潜在应用价值和深远的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器。该荧光生物传感器制备方法简单，所制得的传感器用于乳腺癌的检测时，灵敏度高。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案: 一种用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器，包括碳化氮纳米材料、银离子、DNA 探针，所述的 DNA 探针基因为:5’ -CCCCCCTGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGACCCCCC-3’ ；其中基因片段5’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3’是VEGF的核酸适体部分，可在VEGF存在时折叠成G-四链体结构；银离子、DNA探针混合反应形成发夹结构，加入到碳化氮纳米材料溶液中，测其荧光；然后该体系在靶分子血管内皮生长因子的诱导下，DNA探针与革巴分子结合形成G-四链体结构，发夹结构打开，银离子被释放出来，猝灭碳化氮纳米材料的焚光信号。
[0007]一种制备如上所述的用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器的方法，包括以下步骤:
1)碳化氮纳米材料的制备:将2mL甲酰胺置于微波管中，160~180°C下反应30 min，用双蒸水洗3~4遍，真空干燥8 h后，用去离子水溶解，超声剥离24 h;将得到的液体以15000r/min离心I h，取上清液得碳化氮纳米片混悬液；
2)将10yL 10 mmol/L的硝酸银溶液和50 yL I μ mol/L的探针基因混合，并加入3-吗啉丙磺酸缓冲液稀释至100 μ L，混匀，反应I h ；
3)将步骤2)的混合体系加入到900UL的碳化氮纳米片溶液中，混匀，检测其荧光强度，即得荧光传感器。
[0008]所制得的荧光生物传感器，用于乳腺癌的早期诊断时，对血管内皮生长因子的检测限为 3.5 pmol/Lo
[0009]本发明通过对探针基因的设计，将3’末端和5’末端含有胞嘧啶(C)和能在VEGF诱导下折叠成G-四链体结构的特殊序列的探针基因与硝酸银溶液混合，通过C-Ag+-C的共价结合方式将探针基因折叠成发夹结构；当靶分子存在时，探针基因与靶蛋白结合形成G-四链体结构，发夹结构打开并释放出银离子，银离子与碳化氮纳米材料结合猝灭其荧光，实现了对乳腺癌的早期诊断。该方法对VEGF的检测限为3.5 pmol/Lo
[0010]本发明的有益效果在于:
1)本发明的荧光传感器不含对人体有毒、污染环境的材料，稳定性好、灵敏度高、重现性好，抗环境中其它常见离子干扰的能力强，而且传感器易于制备；
2)本发明利用碳化氮纳米材料在银离子、探针基因和VEGF存在下的荧光猝灭-恢复的性质，制得荧光生物传感器；该传感器实现了对VEGF的灵敏特异性检测，提供了一种更加准确、灵敏、经济、简便、无创的检测新技术，具有巨大的应用前景。
【附图说明】
[0011]图1是碳化氮纳米材料的光谱图，㈧为紫外光谱，(B)为荧光光谱；
图2是碳化氮纳米材料的激发发射光谱；
图3为加入银离子或不同的VEGF后碳化氮纳米材料荧光信号的变化；图中:(a)碳化氮纳米材料的荧光信号，Cd)碳化氮纳米材料中加入银离子的荧光信号，(b)碳化氮中加入银离子和探针基因后的荧光信号，(c)碳化氮中加入银离子和探针基因后再加入靶标蛋白的焚光信号；
图4为本发明的荧光信号检测图。
【具体实施方式】