一种多重pcr肠道致病菌检测引物组、试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多重PCR肠道致病菌检测引物组、试剂盒，属于涉及PCR应用技 术领域。更具体是涉及14种肠道致病菌检测，包括：霍乱弧菌（01群、0139群、非01/0139 群）、单核增生李斯特菌、肠致病性大肠杆菌（EPEC)、肠出血性大肠杆菌（EHEC)、肠产毒性 大肠杆菌（ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC)、肠聚集性大肠杆菌（EAEC)、志贺菌、肠道病毒 EV71、肠出血性大肠杆菌0157 :H7、艰难梭菌、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏 菌。
【背景技术】
[0002] 肠道致病菌引起的传染病是危害公共卫生安全的主要因素。多数国家都采取了相 应的措施检测肠道致病菌和控制疫情的传播。肠道致病菌主要包括单核增生李斯特氏菌、 副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢 杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌0157 : H7、耶尔森氏菌和霍乱弧菌等。
[0003] 国际公认的李斯特菌有10种，其中与人的李斯菌症相关的通常只有单核增生李 斯特氏菌。据报道，有1-10%的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，该菌造成的脑膜炎的 致死率可高达70 %，败血症的死亡率达50 %，围产期或新生儿感染的死亡率超过80 %。李 斯特菌溶血素（GGH)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子，由hlyA基因编码。
[0004] 肠病毒71型（EV71)是肠病毒的一种，多见于东南亚地区的夏季期间，主要病征是 手足口病的一系列征状上包括发烧、食欲不振、喉咙痛及口腔溃疡等。也可能导致神经感 染。目前在我国有逐渐增加的倾向。EV71病毒结构蛋白由VP1基因编码，通过鉴定VP1的 有无判断是感染肠病毒71型。
[0005]志贺菌属的细菌，通称痢疾杆菌，是人类细菌性痢疾的病原菌，以病人和带菌者为 传染源，无动物宿主。其致病物质主要是侵袭力和内毒素，有的菌株尚产生外毒素。
[0006] 霍乱弧菌是霍乱的病原体，根据血清型的不同可以分为01群、0139群、非01/0139 群。01群、0139群霍乱弧菌产生的霍乱肠毒素（也称霍乱毒素）是产生霍乱的主要原因， 也只有01群和01群霍乱弧菌可引起霍乱，而其他群的霍乱弧菌毒性不高。霍乱弧菌的致 病因子主要有CTX元件（其中的CtxA基因编码霍乱肠毒素）、TcpA致病岛（编码TcpA菌 毛）和toxR(毒力调控基因，调节编码CtxA和TcpA的基因）。霍乱弧菌ompW基因编码外 膜蛋白，是所有霍乱弧菌所共有的。研究表明，01群和0139群在许多基因和组成上高度相 似，一些毒力基因CtxA和TcpA基因相同，而通过比对两种血清型霍乱弧菌的糖基转移酶基 因（LPSgt)，发现它们序列存在较大差异。
[0007] 致病性大肠杆菌感染的主要症状是致泻。根据其致病机理不同主要分为肠致病性 大肠埃希菌（EPEC)、肠出血性大肠埃希菌（EHEC)、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC)、肠侵袭性 大肠埃希菌（EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌（EAEC)。eae基因编码一个被称为紧密粘附素的 外膜蛋白，此蛋白能使细菌黏附于宿主肠壁上，是EPEC的重要毒力基因。EHEC的stxl和 stx2基因编码志贺样毒素I和志贺样毒素II。EIEC的invE基因（又称virB)编码蛋白介 导侵袭。ETEC有两种肠毒素不耐热肠毒素（由LT基因编码）和耐热肠毒素基因（可分两 种，分别由ST1和ST2)。EAEC的毒力基因编码蛋白介导集聚性黏附上皮细胞，阻止液体吸 收，其特异性基因为中转录激活因子基因（aggR)。大肠杆菌0157 :H7是肠出血性大肠杆菌 一种主要致病菌，其中rfbE基因编码大肠杆菌0157菌体0抗原（多糖）特异性转移酶，参 与脂多糖的生物合成。
[0008]艰难梭菌（Clostridiumdifficile)为革兰阳性产芽孢厌氧杆菌。艰难梭菌 本身没有侵袭性，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关 性腹泻、结肠炎甚至致死性假膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染（Clostridiumdifficile infection，CDI)。医院获得感染性腹泻所明确的病原中，以艰难梭菌最为常见；在抗生素相 关性腹泻病因中，艰难梭菌亦占20%?30% ;而假膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。 在美国，艰难梭菌感染是引起医院感染性腹泻的第一位原因。
[0009]肠炎弧菌（Vibrioparahaemolyticus,VP)，又称副溶血性弧菌是革兰氏阴性多形 态杆菌或稍弯曲弧菌，属于弧菌属，是一种常见的病原菌。肠炎弧菌是一种嗜盐性的革兰氏 阴性菌，广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。副溶血弧 菌分离株都含有不耐热溶血毒素（tlH)，这种溶血素是副溶血弧菌所特有的，因此它的编码 基因tlH基因常被用作检测副溶血弧菌的靶基因。而tlH并不是一个毒素基因，真正与致 病相关的是副溶血弧菌的耐热直接溶血素（tdH)和溶血相关溶血素（trH)。
[0010] 沙门氏菌（Salmonella)属肠杆菌科，革兰阴性无芽孢杆菌，是一种广泛分布于自 然界的危害极大的肠道致病菌，有其引起的食物中毒数量为世界食物中毒病例之首。按其 抗原成份可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒 甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤 寒杆菌和肠炎杆菌等。沙门菌具有侵袭宿主上皮细胞的能力，其侵袭力和毒力与invA基 因相关。sefA是肠炎沙门菌SEF14菌毛操纵子的亚单位。鞭毛是沙门氏菌的重要毒力基 因，鞭毛提供了的动力可能是细菌侵入细胞的重要因素，而且鞭毛可以作为黏附素，决定了 细菌在细胞表面的吸附，以及其后的侵入和定居过程。fliC是鼠伤寒沙门菌的鞭毛抗原，为 该菌所特有的保守基因。
[0011] 检测和鉴定多种肠道致病菌对于传染病预防控制工作提供了坚实的理论依据和 可靠的技术保障。目前，采用的生化鉴定、定量PCR和ELISA等方法均是对少数细菌进行鉴 另IJ，不能达到短时间内对多种致病菌平行检测和鉴定。
【发明内容】
[0012] 本发明所要解决的技术问题是：常规的肠道致病菌检测方法一次性只能检测较少 肠道致病菌，本申请能够同时检测14种肠道致病菌共26个基因，提出了一种多重PCR肠道 致病菌检测引物组、试剂盒。
[0013] 技术方案：
[0014] 一种多重PCR肠道致病菌检测引物组，所述的引物组包括有如下的引物对中的至 少两对：
[0015]用于扩增单核增生李斯特菌的特异性基因溶血素A基因（hlyA)的引物对、
[0016] 用于扩增肠道病毒EV71的特异性基因结构蛋白基因（VP1)的引物对、
[0017] 用于扩增志贺菌的特异性基因的侵袭性质粒抗原H基因（ipaH)的引物对、
[0018] 用于扩增肠出血性大肠杆菌0157 :H7编码脂多糖基因（rfbE)的引物对、
[0019] 用于扩增霍乱弧菌外膜蛋白基因（ompW)的引物对、
[0020] 用于扩增霍乱毒素基因（CtxA)的引物对、
[0021] 用于扩增霍乱弧菌的毒素协同菌毛基因（TcpA)的引物对、
[0022] 用于扩增霍乱糖基转移酶基因（LPSgt)的引物对、
[0023] 用于扩增肠致病性大肠杆菌（EPEC)的紧密黏附素基因（eae)的引物对、
[0024] 用于扩增肠出血性大肠杆菌（EHEC)的志贺样毒素I基因（stxl)的引物对、
[0025] 用于扩增肠出血性大肠杆菌（EHEC)的志贺样毒素II基因（stx2)的引物对、
[0026] 用于扩增肠产毒性大肠杆菌（ETEC)的不耐热热肠毒素基因（LT)的引物对、
[0027] 用于扩增肠产毒性大肠杆菌（ETEC)的耐热肠毒素ST1基因的引物对、
[0028] 用于扩增肠产毒性大肠杆菌（ETEC)的耐热肠毒素ST2基因的引物对、
[0029] 用于扩增肠侵袭性大肠杆菌（EIEC)的invE基因（又称virB)的引物对、
[0030] 用于扩增肠聚集性大肠杆菌（EAEC)的转录激活因子基因（aggR)的引物对、
[0031] 用于扩增艰难梭菌毒素A基因（tcdA)的引物对、
[0032] 用于扩增艰难梭菌毒素B基因（tcdB)的引物对、
[0033] 用于扩增艰难梭菌二元毒素A基因（cdtA)的引物对、
[0034] 用于扩增艰难梭菌二元毒素B基因（cdtB)的引物对、
[0035] 用于扩增副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因（tlH)的引物对、
[0036] 用于扩增副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因（tdH)的引物对、
[0037] 用于扩增副溶血性弧菌溶血相关溶血素基因（trH)的引物对、
[0038] 用于扩增沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因（invA)的引物对、
[0039] 用于扩增肠炎沙门菌的sefA基因的引物对、
[0040] 用于扩增伤寒沙门氏菌的编码鞭毛抗原基因（flic)的引物对。
[0041] 所述的引物对中的引物碱基序列如下