一种麻虾抗氧化肽及其分离提取方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种麻虾抗氧化肽及其分离提取方法与应用。
【背景技术】
[0002]自由基是人体新陈代谢过程中会产生的一类具有高度氧化活性的有害物质。在正常情况下，机体的免疫系统能够及时地清除自由基，维护机体正常的新陈代谢。但在某些病理情况下，自由基会大量产生并对人体的破坏。氧自由基可使核酸、蛋白、膜多聚不饱和脂肪酸(PUFA)引起超氧化反应、引起细胞结构和功能的破坏等。科学研宄表明，人体许多病态表现都与自由基的产生息息相关，如人体的衰老、氧化性疲劳、炎症和免疫力下降等。因此抗氧化剂的研宄越来越被人们所重视。
[0003]抗氧化肽作为一种天然、安全、高效的抗氧化剂，已成为科学研宄的热点。目前抗氧化肽主要来自植物和动物。植物的抗氧化肽主要来自大豆、核桃和花生等。在近几年，动物抗氧化肽，特别是海洋动物越来越成为研宄的热点。发明申请专利(申请号201310196355.8)公开了一种青养抗氧化肽，并测定其氨基酸序列为Leu-Lys和Phe-Lys，并通过氧自由基吸收能力，得出两种青养抗氧化肽是其粗肽的7.83倍和15.78倍。发明申请专利(申请号201410040473.4)公开了一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽，氨基酸序列为Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg，并通过还原力、DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和超氧阴离子清除率的抗氧化指标证明合浦珠母贝肉抗氧化肽具有很强的抗氧化性。
[0004]麻虾作为一种丰富的海产品的资源，不仅肉质鲜美，含有丰富的蛋白质，同时具有极高的营养价值，含有丰富的生物活性物质。目前，虾肉主要用于食用，如制作虾仁，其余虾的下脚料用于饲料。但对虾活性肽方面的开发较少。
【发明内容】
[0005]为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种麻虾抗氧化肽。
[0006]本发明的另一目的在于提供上述麻虾抗氧化肽的分离提取方法。
[0007]本发明的再一目的在于提供上述麻虾抗氧化肽的应用。
[0008]本发明目的通过以下技术方案实现:
[0009]—种麻好抗氧化肽，所述抗氧化肽具有Gly-Phe-Trp的氨基酸序列。
[0010]上述麻虾抗氧化肽的分离提取方法，包括以下操作步骤:
[0011](I)将麻虾打成浆状，然后与水按质量比为1:(0.5?5)混合，加入蛋白酶酶解I?6h，灭酶，冷却，上清液浓缩干燥，得到麻虾酶解液粉末；
[0012](2)将麻虾酶解液粉末采用弱极性树脂进行分离，依次用蒸馏水、体积分数为10%?29%、30%?49%、50%?69%及70 %?89 %的乙醇溶液梯度洗脱，收集10%?29%的乙醇溶液洗脱组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B ;
[0013](3)将肽粉B用葡聚糖凝胶色谱柱分离，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集第三个组分冷冻干燥，得到肽粉B3 ;
[0014](4)将肽粉B3采用反相高效液相色谱进行进一步分离纯化，A相-B相为流动相进行洗脱，其中A相为乙腈，B相为体积分数为0.1%?0.2%的三氟乙酸水溶液，按洗脱的时间先后依次得到两个组分，收集第二个组分冷冻干燥处理，得到氨基酸序列为Gly-Phe-Trp的麻虾抗氧化肽。
[0015]步骤(I)中所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶或胰酶中的一种或两种，蛋白酶添加量为500?5000U/g原料；所述酶解的pH为6.5?8.0，酶解温度为45?55°C。
[0016]步骤(I)中所述的灭酶是指在85?100°C下保温10?30min。
[0017]步骤⑵中所述的弱极性树脂优选XAD-16树脂。
[0018]步骤(3)中所述的葡聚糖凝胶色谱柱优选Sephadex G_15葡聚糖凝胶色谱柱。
[0019]步骤(4)中所述的分离纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱，洗脱程序为:0-7min内采用A相体积分数为5% ;7_12min内A相体积分数逐渐增加至38% ；12-20min内A相体积分数逐渐增加至55%，20-25min内A相体积分数逐渐增加至90%，25_30min A相的体积分数为90%。
[0020]上述麻虾抗氧化肽在食品、化妆品和医药领域中的应用。
[0021]通过本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果:
[0022](I)目前，虾肉主要用于食用，如制作虾仁，其余虾的下脚料用于饲料。但对虾活性肽方面的开发较少，本发明通过酶解分离纯化得到的麻虾肽，作为一种抗氧化肽，提高虾的利用价值；
[0023](2)本发明制备的抗氧化肽具有很强的抗氧化活性，其氧自由基吸收能力为麻虾酶解液粉末的10倍以上，可以作为功能性成分，用于食品、化妆品和药品领域；
[0024](3)本发明制备的抗氧化肽为三肽，分子量为408.1798Da，可以被人体直接吸收。
【附图说明】
[0025]图1为实施例5的S印hadexG-15葡聚糖凝胶色谱柱分离后得到的三个组分的吸光度；
[0026]图2为实施例5的反相高效液相色谱柱XBridge? prep C18柱分离的两个组分的谱图；
[0027]图3为实施例5的麻虾抗氧化肽的氨基酸序列的质谱分析图；
[0028]图4为实施例5的麻虾酶解液和树脂XAD-16分离得到的五个组分的抗氧化活性测定图。
[0029]图5为实施例5的S印hadexG-15葡聚糖凝胶色谱柱分离后得到的三个组分的抗氧化活性测定图；
[0030]图6为实施例5的反相高效液相色谱柱XBridge? prep C18柱分离得到的两个组分的抗氧化活性测定图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0032]实施例1
[0033](I)将麻虾打成浆状，再与水按质量比1:0.5混合，加入木瓜蛋白酶，酶添加量为5000U/g原料，酶解pH为8.0，酶解温度为45°C的条件下酶解Ih ;然后在85°C的水中保温30min灭酶，冷却，取上清液，浓缩，喷雾干燥得到麻虾酶解液粉末，酶解液的水解度为21.3±0.4% ；
[0034](2)得到的麻虾酶解液粉末首先采用弱极性树脂XAD-16，通过蒸馏水和体积分数为10 %、30 %、50 %及70 %的乙醇溶液对麻虾酶解液粉末进行浓度梯度洗脱，收集10 %的乙醇溶液洗脱组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B ;
[0035](3)将步骤⑵得到的肽粉B进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集第三个组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B3 ;
[0036](4)将步骤(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色谱进行进一步纯化，按洗脱的时间先后依次得到两个组分，收集第二个组分冷冻干燥处理，得到肽粉B3-1I ;其中色谱纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱，流动相为A相-B相，所述A相为乙腈，B相为体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液。洗脱程序为:0-7min内采用A相体积分数为5% ;7_12min内A相体积分数逐渐增加至38%;12-20min内A相体积分数逐渐增加至55%，20_25min内A相体积分数逐渐增加至90%，25-30min内A相的体积分数为90%。
[0037]本实施得到的麻虾抗氧化肽，即肽粉B3-1I，通过UPLC-MS-MS测定肽的分子量为408.1798Da 和氨基酸序列为 Gly-Phe-Trp。
[0038]实施例2
[0039](I)将麻虾打成浆状，再与水按质量比1:5混合，加入胰酶，酶添加量为500U/g原料，酶解PH为7.0，酶解温度为55°C的条件下酶解6h ;然后在100°C的水中保温1min灭酶，冷却，取上清液，浓缩，喷雾干燥得到麻虾酶解液粉末，酶解液的水解度为19.4±0.3% ；
[0040](2)得到的麻虾酶解液粉末首先采用弱极性树脂XAD-16，通过蒸馏水和体积分数为29 %、49 %、69 %及89 %的乙醇溶液对麻虾酶解液粉末进行浓度梯度洗脱，收集29 %的乙醇溶液洗脱组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B ;
[0041](3)将步骤(2)得到的肽粉B进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集第三个组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B3 ;
[0042](4)将步骤(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色谱进行进一步纯化，按洗脱的时间先后依次得到两个组分，收集第二个组分冷冻干燥处理，得到肽粉B3-1I ;其中色谱纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱，流动相为A相-B相，所述A相为乙腈，B相为体积分数为0.2%的三氟乙酸水溶液。洗脱程序为:0-7min内采用A相体积分数为5% ;7_12min内A相体积分数逐渐增加至38%;12-20min内A相体积分数逐渐增加至55%，20_25min内A相体积分数逐渐增加至90%，25-30min内A相的体积分数为90%。
[0043]本实施得到的麻虾抗氧化肽，即肽粉B3-1I，通过UPLC-MS-MS测定肽的分子量为408.1798Da 和氨基酸序列为 Gly-Phe-Trp。
[0044]实施例3
[0045](I)将麻虾打成浆状，再与水按质量比1:2混合，加入木瓜蛋白酶和胰酶的混合酶，酶添加量为2000U/g原料，酶解pH为6.5，酶解温度为50°C的条件下酶解4h ;然后在900C的水中保温20min灭酶，冷却，取上清液，浓缩，喷雾干燥得到麻虾酶解液粉末，酶解液的水解度为20.9±0.3% ;
[0046](2)得到的麻虾酶解液粉末首先采用弱极性树脂XAD-16，通过蒸馏水和体积分数为15 %、35 %、55 %及75 %的乙醇溶液对麻虾酶解液粉末进行浓度梯度洗脱，收集15 %的乙醇溶液洗脱组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B ;
[0047](3)将步骤⑵得到的肽粉B进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S^hadex G_15柱层析分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集第三个组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B3 ;
[0048](4)将步骤(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色谱进行进一步纯化，按洗脱的时间先后依次得到两个组分，收集