从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白纯化技术领域，尤其涉及从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]前白蛋白(Prealbumin，PA)由肝细胞合成，又称转甲状腺素蛋白(transthyretin)，分子量54KD，它是一种运载蛋白，它能结合甲状腺素T4与T3，PA与视黄醇结合蛋白形成的复合物，具有运载维生素A的作用。前白蛋白在人血液中正常含量约300mg/L，其半衰期很短，仅约1.9天。因此，测定其在血浆中的浓度对于了解蛋白质的营养不良、肝功能不全、比之白蛋白和转铁蛋白具有更高的敏感性。除了作为一种灵敏的营养蛋白质指标，PA在急性炎症、恶性肿瘤、肝硬化或肾炎时其血浓度下降。
[0003]视黄醇结合蛋白(Retinol binding protein, RBP)主要由肝细胞合成，分子量21KD，是一种低分子量的亲脂载体蛋白。RBP广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，视黄醇结合蛋白与视黄醇、前白蛋白以复合物形式存在，转运视黄醇至机体组织，当RBP与细胞表面的RBP受体结合，视黄醇进入细胞内，复合体解体，游离的RBP从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收，并被分解成氨基酸，供组织利用，仅有少量从尿中排出。当肾脏疾患或感染等导致肾小管重吸收功能障碍时，尿中RBP浓度升高，血清RBP浓度下降。因此尿中RBP测定是诊断早期肾小管损伤的敏感指标。由于其具有半衰期短的特点，RBP还可特异地反映机体的营养状态，因此也是一项诊断早期营养不良的敏感指标。
[0004]由于前白蛋白与视黄醇结合蛋白在疾病诊断中的应用，开发高效的纯化方案具有显著的现实意义和应用价值。现有报道的相关纯化技术方法，仅能够纯化前白蛋白或视黄醇结合蛋白其中一种蛋白，见胡大荣等著“人血浆前白蛋白的纯化及其抗血清制备”(《解放军医学杂志》1986年05期)；赵霞等著“人血浆前白蛋白的分离和纯化”(《上海第二医科大学学报》1995年03期)；金宏等发表的“视黄醇结合蛋白的分离纯化及其抗血清的制备”(《生物化学与生物物理进展》1993年06期)。上述方法均不能实现从血浆中同时纯化PA和RBP的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种高效的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，旨在解决现有技术不能从血浆中同时纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的问题。
[0006]本发明是这样实现的，一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，包括下述步骤:
[0007]取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体；
[0008]使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物；
[0009]将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品；
[0010]使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。
[0011]本发明提供的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，基于血浆中PA与RBP以复合物形式存在的特点，并根据PA-RBP复合物及其组成部分PA和RBP表面电荷或疏水性的差异，采取柱层析技术，可以获得高纯度的PA和RBP，从而同时实现了对两种蛋白质的纯化，该方法不仅简单可行，还是一种一举两得的高效技术方法。
【附图说明】
[0012]图1是本发明实施例第一次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线图；
[0013]图2是本发明实施例第二次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线图；
[0014]图3是本发明实施例第三次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线图；
[0015]图4是本发明实施例所述方法中各步纯化样品的SDS-PAGE蛋白电泳检测图谱。
【具体实施方式】
[0016]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0017]本发明实施例基于血浆中PA及RBP以复合物的形式存在，并根据PA-RBP复合物组成特点、研宄其组成部分PA和RBP表面电荷或疏水性的差异，进而研发了一种基于层析技术手段、可同时纯化制备此两种蛋白质的技术方法。本发明实施例是通过下述技术方案实现:
[0018]一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，包括下述步骤:
[0019]S01.取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体；
[0020]S02.使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物；
[0021]S03.将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品;
[0022]S04.使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP0
[0023]上述步骤SOl中，所述血浆不受限制，可取自人类或其他动物的血浆，如鼠血浆、猴血浆等。本发明实施例PA-RBP复合物，不同类型的柱色谱也许都能在一定程度上实现PA-RBP复合物的分离，然而，对于产业化生产而言，成本的控制至为重要，而生产效率的提高是降低生产成本的重要因素。因此，在保证分离效果的前提下，尽可能的提高所述PA-RBP复合物中PA和RBP的纯化效率，是本领域技术人员所要研宄的重点、也是难点。发明人基于柱层析技术，寻找可用于分离血浆PA-RBP复合物的离子色谱填料。本申请发明人基于所述PA-RBP复合物的组成对其电荷特点进行分析:本发明实施例所述PA分子单体由147个氨基酸组成，其中，包括18个带负电荷的氨基酸和13个带正电荷的氨基酸，完整的4聚体PA分子等电点为4.7，在pH中性溶液中带负电荷；而所述RBP分子单体由135个氨基酸组成，其中，包括25个带负电荷的氨基酸和19个带正电荷的氨基酸，所述RBP分子等电点为4.4，在pH中性溶液中带负电荷；所述PA-RBP复合物经软件预测等电点为4.5，在中性溶液中也携带较多的负电荷。有鉴于此，发明人基于所述PA-RBP复合物的电荷性，对填料选择进行了反复研宄。经研宄发现，采用阴离子交换填料与所述PA-RBP复合物结合，所述PA-RBP复合物吸附在阴离子交换填料表面，进而进行柱洗脱，能获得较好的初提效果。本发明实施例基于PA-RBP复合物表面电荷特性，优选使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血浆中进行第一次层析纯化处理，初步分离获得PA-RBP复合物初体。
[0024]柱层析技术中，上样物质与填料的用量比对色谱效果的影响很大。本发明实施例中，为了提高色谱效果、进而获得纯度较高的PA-RBP复合物初体，同时节约填料成本，在使用离子交换层析柱对血浆进行第一次层析纯化处理的步骤中，所述阴离子交换柱的填料和所述样品的体积比为1: (1-1.2)。作为进一步优选实施例，所述阴离子交换柱的填料和所述样品的体积比为1:1。
[0025]在进行第一次层析纯化处理上样之前，需要对所述血浆进行前处理，具体的，所述前处理的方法为:先采用缓冲溶液调整所述血浆，一方面，使得血浆与缓冲溶液充分结合，形成血浆体系；另一方面，采用缓冲溶液调整所述血浆的PH，防止柱色谱过程中，由于血浆样品与洗脱体系不一致导致的溶液扩散、进而影响色谱带扩散造成色谱效果不好的现象；将上述调整后的血浆进行离心处理后取上清液备用。作为具体实施例，当使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血楽进行第一次层析纯化处理时，采用IM的Tris_base溶液将所述血浆PH调整为9后进行离心处理，取上清液。
[0026]作为具体优选实施例，在所述血浆上柱前，还包括对层析柱进行柱平衡处理；在所述血浆上柱后，对血浆样品进行冲洗处理。如:当使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血浆中进行第一次层析纯化处理时，所述柱平衡处理和所述对血浆样品进行冲洗处理均采用平衡液进行洗脱，作为优选实施例，所述平衡液为Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为150mM、且PH9.0的平衡体系。
[0027]洗脱体系是影响柱层析分离效果的重要因素。作为具体实施例，当使用阴离子交换填料UNOsphere Q对血楽中进行第一次层析纯化处理时，所述洗脱体系采用Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为500mM、且PH9.0的洗脱液。
[0028]其中，所述Tris-HCl缓冲溶液在碱性区具有较强的缓冲能力，pH缓冲范围7.1-9.0。随着溶液pH的升高，所述PA-RBP复合物表面净负电荷越多，与阴离子交换填料UNOsphere