一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物免疫技术领域，具体涉及一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗 体及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 传染性脾肾坏死病毒（InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus，ISKNV) 是虹彩病毒科（Iridoviridae)肿大细胞病毒属（Megalocytivirus)的代表种，是一类具有 正二十面体的胞浆型大型双链DNA病毒，基因组由111，362个碱基组成，包括125个预测开 放读码框ORF(openreadingframes)。ISKNV可以感染近60种淡水和海水鱼，是鱖、加洲 鲈和美国红鱼养殖业的巨大威胁，鱖鱼是其主要感染宿。
[0003] 鱖（Sinipercachuatsi)是隹卢形目真隹卢科鱖属的鱼类，俗称鱖鱼、花鲫鱼、桂鱼、季 花鱼等，是中国特产的一种食用淡水鱼，也是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一；由传染 性脾肾坏死病毒（Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)引起的繼鱼虹 彩病毒病是鱖鱼养殖的主要疫病，导致顿死亡率接近100%，成为制约鱖养殖业发展的主要 瓶颈。自1994年以来，ISKNV引起了广东省的鱖养殖重大经济损失，其传染力强，发病率高 达30 %，致死率高达90 %以上，平均每年经济损失高达2亿元。对ISKNV的感染进行检测， 是防止该病毒病暴发的必要手段。目前国内外针对该病毒的诊断方法局限于聚合酶链式反 应（PCR)技术，尚未有其它诊断方法的报道，PCR检测法需要提纯病鱼组织DNA，且假阳性率 较高，限制了该方法的推广和使用。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测传染性脾肾坏死病毒 抗体，以多肽为抗原获得特异性的传染性脾肾坏死病毒抗体，该多肽序列与虹彩病毒属其 它种病毒的同源性较低，无连续5个以上氨基酸相一致，该抗体用于检测传染性脾肾坏死 病毒，具有特异性。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体，其为兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体，是以含 有序列号为SEQIDNO:1的一段氨基酸残基为表位抗原，获得特异性识别ISKNV-23P8的多 克隆抗体。
[0007] 本发明还提供了一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体的制备方法，通过该方法获 得一种特异性识别ISKNV的多克隆抗体，用于荧光免疫检测传染性脾肾坏死病毒。
[0008] 为实现上述目的，本发明中所述的制备方法的具体方案如下。
[0009] -种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体的制备方法，利用Antigenic和DNAstar/ protean抗原决定簇分析软件对传染性脾肾坏死病毒毒株编码的膜蛋白VP23R的氨基酸 序列进行分析，筛选出一段14个氨基酸残基抗原表位的多肽片段，并以该多肽片段制备抗 VP23R蛋白的兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体；所述多肽片段的序列为SEQIDNO:1。
[0010] 具体地，所述的制备方法包括以下步骤：
[0011] 1)合成多肽：以上述多肽片段为模板，用生物学方法合成多肽，用HPLC对合成的 多肽进行纯化，纯度在85%以上；
[0012] 2)耦联：将上述步骤1)合成多肽耦联至钥孔血蓝蛋白（KLH)中，获得23P8-KLH复 合物；
[0013] 3)乳化：用弗氏完全佐剂对上述步骤2)得到的23P8-KLH复合物进行乳化；
[0014] 4)免疫：用上述步骤3)的乳剂免疫新西兰大白兔，背部皮下多点注射，首免后 10-15天，用弗氏不完全佐剂乳化的23P8-KLH进行一次加强免疫；
[0015] 5)血清抗体的检验与制备：加强免疫后7天，用Western-blotting检测兔血清中 特异抗体的生成情况；
[0016] 6)亲和层析：利用ISKNV-23P8耦联的琼脂糖凝胶对血清中特异抗体进行亲和层 析，获得兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体。
[0017] 进一步地，步骤5)的具体方法为：以ISKNV感染48小时后的MFF-I细胞培养上清 为样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜，用10%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素 膜，37°C，Ih;然后分别加入1:4000倍稀释的兔血清，4°C，过夜后，用TBST清洗3次硝酸纤 维素膜；然后加入2000倍稀释的HRP-羊抗兔IgG二抗，37°C，lh，用TBST清洗3次硝酸纤 维素膜，用DAB显色试剂进行显色；待分子量为200KDa的蛋白显色则判定为ISKNV-23P8血 清抗体阳性；通过耳部静脉血管采集兔子血液，室温下放置1小时后，4°C，过夜，3000rpm离 心5分钟，收集血清。
[0018] -种检测传染性脾肾坏死病毒的免疫荧光检测试剂盒，其包含本发明所述的检测 传染性脾肾坏死病毒的抗体。
[0019] 本发明还提供了一种传染性脾肾坏死病毒感染非诊断性的印片免疫荧光快速检 测方法，该方法具有特异性好、操作简单、快速、灵敏的特点，较PCR方法有明显优势，全部 操作可在1. 5小时内完成，可用于各种易感鱼类养殖过程中的ISKNV感染检测。
[0020] 一种传染性脾肾坏死病毒感染非诊断性的印片免疫荧光快速检测方法，包括以下 步骤：
[0021] 1)疑似染病组织处理：取疑似ISKNV感染的病鱼脾脏组织，以刀片切开脾脏，在载 玻片上印片；
[0022] 2)固定：以4%多聚甲醛溶液覆盖上述载玻片，室温固定3-10min;
[0023] 3)封闭：经步骤2)固定后的载玻片用含有1%牛血清白蛋白的PBST溶液于室温 封闭 10-20min;
[0024] 4)抗体抚育：经步骤3)处理后的载玻片加入用PBST以体积比为I:1000-3000比 例稀释的本发明所述的检测传染性脾肾坏死病毒的抗体（即特异性识别ISKNV-23P8的多 克隆抗体），室温抚育30-50min，再以PBST充分洗涤；
[0025] 5)荧光标记：上述步骤4)处理后的载玻片加入荧光标记的羊抗兔IgG二抗，抚育 20-40min，再用PBST洗涤；
[0026] 7)检测焚光信号：载玻片经焚光标记后，用盖玻片封片，免疫焚光显微镜镜检测， 检测焚光信号。
[0027] 具体地，步骤1)所使用的载玻片经硅化或经多聚赖氨酸处理。
[0028] 具体地，步骤1)以新鲜脾脏的剖切面在载玻片上进行印片。
[0029] 具体地，步骤5)中，所述羊抗兔IgG二抗采用FITC荧光标记。
[0030] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0031] 1.本发明所述的检测传染性脾肾坏死病毒抗体可特异性识别ISKNVVP23R的条 带，与不含有VP23R的蛋白之间无交叉反应；
[0032] 2.本发明所述的检测传染性脾肾坏死病毒的免疫荧光检测试剂盒利用特异性识 别ISKNV编码的特有细胞膜定位蛋白VP23R的多克隆抗体，对病鱼组织中病毒感染细胞进 行免疫荧光检测，具有特异性好、操作简单、快速、灵敏等优点；
[0033] 3.本发明所述的传染性脾肾坏死病毒感染非诊断性的印片免疫荧光快速检测方 法具有特异性好、操作简单、快速、灵敏的特点，较PCR方法有明显优势，全部操作可在1. 5 小时内完成，可用于各种易感鱼类养殖过程中的ISKNV感染检测。
[0034] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0035] 图1为鱖脾脏组织切片的免疫荧光图；其中，A、B为感染ISKNV的鱖脾脏组织切 片，其中B为激发光下的荧光细胞，可见本发明的兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体可特异性识 别ISKNV感染的脾脏组织细胞；C、D为健康鱖脾脏组织切片，其中D为激发光下的组织细 胞，未感染IKSNV的健康鱼脾脏组织无荧光信号；
[0036] 图2为ISKNV感染发病的鱖鱼脾脏组织印片免疫荧光检测结果图；其中A图为激 发光下的荧光图，B图为白光下图片；
[0037] 图3健康鱖鱼脾脏组织印片免疫荧光检测结果图，A为激发光下的荧光图，B为白 光下图片；
[0038] 图4为鱖脾脏组织样品Western-blotting结果图；泳道1::感染ISKNV的鱖脾脏 组织；泳道2:健康鱖脾脏组织；
[0039] 图5为，其中a图为激发光下的荧光图，b图为白光下图片
[0040] 图6为，其中a图为激发光下的焚光图，b图为白光下图片。
【具体实施方式】
[0041] 一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体，其为兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体，是以含 有序列号为SEQIDNO:1的一段氨基酸残基为表位抗原，获得特异性识别ISKNV-23P8的多 克隆抗体。
[0042] -种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体的制备方法，利用Antigenic和DNAstar/ protean抗原决定簇分析软件对传染性脾肾坏死病毒毒株编码的膜蛋白VP23R的氨基酸 序列进行分析，筛选出一段14个氨基酸残基抗原表位的多肽片段，并以该多肽片段制备抗 VP23R蛋白的兔抗ISKNV-23P8多克隆抗体；所述多肽片段的序列为SEQIDNO:1。
[0043] 以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所涉及的
[0044] 实施例1
[0045] -种检