靶向b淋巴瘤细胞的人源单链抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地涉及可靶向B淋巴瘤细胞的 编码包含人源CD19抗体可变区片段的DNA、其所编码的重组蛋白、该重组蛋白的生产方法、 该重组蛋白的用途。
【背景技术】
[0002] B淋巴细胞是一种在人体内广泛分布的免疫细胞，在体液免疫中发挥重要作 用。B淋巴细胞如果发生恶性转化，可以导致淋巴瘤的发生。研宄表明，⑶19(clUSterof differentiation3)在多种B细胞相关的恶性肿瘤细胞表面高表达，包括急性非霍奇金淋 巴瘤、B淋巴细胞白血病等，而且⑶19在B淋巴细胞发育的早期阶段就开始表达，几乎涵盖 B细胞发育的各个阶段，因此是CD19诊断和治疗的B细胞淋巴瘤的理想靶点。目前，针对B 淋巴细胞表面的另一分子CD20为靶点的抗体药物美罗华（Rituximab)已经在临床应用，取 得了较好的疗效。因此，针对CD19的抗体也具有成为治疗B细胞相关恶性肿瘤药物的潜在 价值。
[0003] 抗体药物是一类重要的生物技术药物，主要以gamma球蛋白为主，即IgG型抗体。 IgG型抗体由2条重链和2条轻链通过二硫键构成，分子量约150kD。作为人体治疗用的单 克隆抗体主要为IgG型嵌合抗体和采用CDR移植技术构建而成的人源化抗体。在这些抗体 中，原来鼠源的抗体恒定区被替换为人源抗体恒定区，甚至鼠源抗体可变区中框架区的部 分氨基酸也被替换为人源抗体基因的氨基酸。通过这些改造，在一定程度上减少了原来鼠 源抗体疗法引起的HAMA(Humanantimousantibody)效应的发生，提高了临床治疗效果。尽 管如此，由于抗体可变区的部分氨基酸仍然为鼠源序列，因此无法完全避免HAM效应的发 生。
[0004] 从抗体药物应用来说，人源抗体是用于人体治疗最理想的抗体，可以有效减少 抗-抗体的产生，这可以有效避免抗体药物的耐药。但是由于技术上的难度，目前世界上成 功的人源抗体极少。首先，由于伦理限制，无法采用类似制备小鼠杂交瘤细胞的方法借助人 体生产人源抗体。其次，目前世界上转人源抗体基因的工程小鼠极少，更为关键的是由于抗 体多样性产生的过程需要重链V-D-J基因重排和轻链V-J基因重排，而人抗体基因重排过 程在小鼠体内受到很大限制，因此导致抗体的多样性受限。另外，抗体库技术近年来也被用 于筛选人源抗体，但是由于缺乏类似人体内生发中心中的抗体亲和力成熟过程，因此产生 的抗体亲和力往往较低。然而，由于人源抗体独特的优势和巨大的治疗价值，目前已经成为 抗体药物发展的重要方向。已经上市的阿达木单抗（adalimumab)就是通过抗体库技术产 生的人源单克隆抗体，用于治疗自身免疫性疾病，已经获得了巨大成功。
[0005] 近年来，基因工程抗体发展迅速，其中单链抗体（single-chainvariable fragment，scFv)就是一种重组小分子抗体。单链抗体由重链可变区和轻链可变区通过一 条柔性连接肽构成，其大小仅为完整IgG型抗体的1/6,因而具有较好的组织渗透性。由于 其体积较小，单链抗体也被经常与其他效应分子融合，作为重组蛋白药物的靶向识别域。因 此，单链抗体具有十分广阔的应用前景。尽管如此，由于缺乏抗体恒定区的支撑，因此并非 所有单链抗体都能够保留有效的抗体结合活性，需要进行检验证实。而且，多数单链抗体的 结合活性不足，往往需要进一步优化，因此获得具有足够结合活性的单链抗体是比较有挑 战性的工作。
[0006] 鉴于此，本发明提供了一种⑶19单链抗体，特别的是，其重链和轻链可变区来源 于人类抗体胚系基因，因此组成此CD19单链抗体的氨基酸为人源抗体序列。本发明的CD19 人源单链抗体能够结合CD19阳性的B淋巴瘤细胞，展现出良好的生物学活性。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗人CD19的人源单链抗体，其能够结 合⑶19阳性的B淋巴瘤细胞。
[0008] 本发明首先提供了一种抗人CD19的抗体轻链可变区，其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO. 4所示。
[0009] 本发明还提供了一种抗人CD19的抗体重链可变区，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 上述的两段序列均为本发明首次获得的人源化序列。
[0011] 在获得了上述人源化序列的基础上，本发明提供了一种抗人CD19的单链抗体，该 单链抗体是是由上述的抗人CD19的抗体轻链可变区和抗人CD19的抗体重链可变区连接而 成。
[0012] 轻链可变区和重链可变区的排列方式为VH-VL或VL-VH，VH位于单链抗体的N端， VL位于单链抗体的C端，表示为⑶19ScFv-VHVL。VL位于单链抗体的N端，VH位于单链抗 体的C端，表示为CD19ScFv-VLVH，
[0013] 其中，上述抗人CD19的单链抗体中，所述的抗人CD19的抗体轻链可变区和抗人 CD19的抗体重链可变区之间通过连接肽进行连接。连接肽可用本领域常用的各种连接肽。
[0014] 其中，上述抗人⑶19的单链抗体中，其结构可选的为轻链可变区-重链可变区、重 链可变区-轻链可变区、轻链可变区-连接肽-重链可变区或重链可变区-连接肽-轻链 可变区中的任意一种。
[0015] 其中，在上述抗人CD19的单链抗体中，所述的连接肽的氨基酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDN0.9)或VEGGSGGSGGSGGSGGVD(SEQIDN0.10)。
[0016] 优选的，上述抗人⑶19的单链抗体的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 6或SEQ IDNO. 8 所述。
[0017] 本发明还提供了编码上述抗人⑶19的抗体轻链可变区的基因。本发明提供了编 码上述述抗人⑶19的抗体重链可变区的基因。本发明还提供了编码上述的的抗人⑶19的 单链抗体的基因。
[0018] 其中，上述的编码抗人CD19的抗体轻链可变区的基因，其核苷酸序列如序列表中 的SEQIDNO. 3或其简并序列所示。
[0019] 上述的编码抗人⑶19的抗体重链可变区的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO. 1或其简并序列所示。
[0020] 其中，上述的编码抗人⑶19的单链抗体的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO. 5或7所示，或为它们的简并序列所示。
[0021] 在上述方案的基础上，本发明还提供了上述编码基因的重组载体。这些种族载体 可以选自质粒或病毒。
[0022] 本发明也进一步地提供了包含上述重组载体的宿主细胞。所述宿主细胞可是真核 细胞或原核细胞。
[0023] 本发明还提供了上述的抗人CD19的单链抗体在制备T淋巴细胞结合剂中的应用。
[0024] 本发明还提供了编码上述⑶19抗体的重链可变区、轻链可变区、重组单链抗体的 核苷酸序列，其核苷酸序列分别为SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 7 所示，或者为它们的简并序列。
[0025] 本发明还提供了含有上述CD19单链抗体核苷酸序列的基因载体。该载体可选自 质粒或病毒。
[0026] 本发明还提供了含有上述基因载体的宿主细胞。该宿主细胞可选自真核细胞或原 核细胞。
[0027] 本发明另外还提供了上述⑶19单链抗体的应用。
[0028] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗人CD19的人源单链抗体，其能够结 合⑶19阳性的B淋巴瘤细胞。
[0029] 优选的，上述⑶19单链抗体的重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 2所 示，轻链可变区氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 4所示。
[0030] 进一步的，重链和轻链可变区之间由连接肽连接。常用的连接肽氨基酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS，或其他有类似作用的连接肽。
[0031] 其中，上述⑶19单链抗体可变区由重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)通过连接 肽（GGGGSGGGGSGGGGS)融合而成，排列方式为VH-VL，VH位于单链抗体的N端，VL位于单链 抗体的C端，表示为⑶19ScFv-VHVL，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 6所示。
[0032] 可选的，上述⑶19单链抗体可变区由轻链可变区（VL)和重链可变区（VH)通过连 接肽（VEGGSGGSGGSGGSGGVD)融合而成，排列方式为VL-VH，VL位于单链抗体的N端，VH位 于单链抗体的C端，表示为⑶19ScFv-VLVH，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 8所示。
[0033] 本发明还提供了编码上述⑶19抗体的重链可变区、轻链可变区、重组单链抗体的 核苷酸序列，