枝孢霉zf-35及在制备羟化环氧黄体酮中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株新的海洋真菌，特别涉及一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其对环氧 黄体酮进行生物转化从而获得羟化环氧黄体酮的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 生物转化是在细胞或酶等生物催化剂催化下进行某种化学修饰的化学反应，广泛 应用于天然产物的生物合成、药物前体化合物的转化、有机化合物的不对称合成、药物代 谢研宄等领域，在结构复杂的天然产物的结构修饰中显示了巨大的应用潜力。A. Christy Hunter等利用曲霉属真菌tamarii KITA对一系列的5-enesteroids进行了生物转化 的研宄，确证了 5-enesteroids的代谢途径涉及了内醋化酶和轻基化酶的共同作用，首 次证明了真菌具有同时调控dehydroepiansdrosterone以及含有c-17侧链的留体类化 合物的作用。Kun Chen，Wang-Yu Tong等利用犁头霉属coerulea IBL02实现了 16 α， 17 α -epoxyprogesterone 的 Cn_β 轻基化。
[0003] 近20年间，随着陆生资源的急剧减少，人类面临着可持续发展与资源匮乏的矛 盾，从而使开发海洋资源成为不可抗拒的热潮。海洋微生物的多样性加之生长环境的特殊 性，决定了其独特的多元结构是陆生植物无法比拟的，其新颖性和复杂性是科学家无法预 测的，因此海洋真菌内新颖的代谢体系，或许能作为环氧黄体酮转化的新体系，从而成为新 药研制开发的基础。
[0004] 本发明以海洋真菌为研宄对象，以环氧黄体酮为底物，研宄了海洋真菌对环氧黄 体酮的转化工艺。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其微生物转化制备羟化环氧黄 体酮的方法，该方法通过枝孢霉转化获得了多种羟化产物，解决了化学合成羟化环氧黄体 酮困难，污染严重的问题。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一株新菌株一枝孢霉（Cladosporium sphaerospermum) ZF-35,保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No !M2014399,保藏日期2014年9月5日，地 址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
[0008] 本发明还提供了一种所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，所述的 应用为：以16 α，17 α -环氧黄体酮为底物，以无水乙醇为反应介质，以枝孢霉ZF-35经发酵 培养获得的含菌发酵液为酶源，在25?30°C、160?200rpm下进行转化反应，转化反应结 束后（优选反应2-3天），将转化反应液分离纯化，获得羟化环氧黄体酮；所述酶源的用量 以含菌发酵液中湿菌体的重量计为〇. 25?0. 8g/mL反应介质，所述16 α，17 α -环氧黄体 酮用量为〇. 1?〇. 3g/mL反应介质。
[0009] 本发明所述应用中底物先与反应介质混合后，再加入酶源中进行转化反应。
[0010] 进一步，优选所述酶源按如下步骤制备：
[0011] ⑴种子培养
[0012] 将接种环灭菌，无菌操作挑取保藏于液体石蜡的斜面中的枝孢霉ZF-35真菌孢 子，用划线法接入新制备含种子培养基的培养皿中；将培养皿倒置于28°C的恒温培养箱中 培养2天后，出现明显的单菌落，继续培养约3?4d，出现分生孢子，获得种子菌落；
[0013] 种子培养基终浓度组成：葡萄糖5?15g/L，酵母浸粉1?I. 5g/L，蛋白胨1. 5? 2. 5g/L，琼脂15?20g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4?6 ; 优选种子培养基组成为：葡萄糖7?12g/L，酵母浸粉I. 1?I. 3g/L，蛋白胨1. 7?2. 2g/ L，琼脂17?21g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4?5 ;
[0014] 人工海水终浓度组成：NaCl 24. 477g/L、MgCl2 · 6H20 4. 9810g/L、Na2S043 . 9 1 70g/ LXaCl2 *H20 I. 1020g/L,KCl 0. 6640g/L,NaHCO3O. 1920g/L,KBr 0. 0960g/L,H3BO3O. 0260g/ L、SrCl2O. 0240g/L、NaFO. 0039g/L，溶剂为蒸馏水；
[0015] ⑵发酵培养
[0016] 用接种环挑取种子菌落接种于发酵培养基中，放入25?30°C恒温培养箱中培养 3?4天至菌体湿重为30?60g/L发酵液，获得含菌发酵液；
[0017] 发酵培养基终浓度组成：葡萄糖25?35g/L，玉米浆20?30g/L，硫酸铵1. 5? 2g/L，酵母粉0. 5?lg/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4? 6 ;优选发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖27?30g/L，玉米浆22?27g/L，硫酸铵1. 7? I. 9g/L，酵母粉0. 6?0. 9g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为 4?5 ;所述人工海水的组成同种子培养基；所述人工海水的组成同种子培养基。
[0018] 进一步，优选所述反应液分离纯化的方法为：转化反应结束后，将反应液过滤，滤 液用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层减压蒸馏获得产物浸膏，再将产物浸膏进行硅胶柱层析， 分别以体积比1:4的乙酸乙酯和石油醚混合液，体积比1 :3的乙酸乙酯和石油醚混合液、体 积比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液、体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液、无水乙酸乙 酯为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液对应的流 出液，得到转化产物1 ;收集体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液对应的流出液，得到转 化产物2 ;收集无水乙酸乙酯对应的流出液，得到转化产物3,分别干燥，获得三种羟化环氧 黄体酮。
[0019] 更进一步，优选所述酶源的用量以含菌发酵液中湿菌体的重量计为0. 25?0. 6g/ mL反应介质，所述16 α，17 α -环氧黄体酮用量为〇. 1?〇. 2g/mL反应介质。
[0020] 本发明采用从东海海水中分离获得的具有环氧黄体酮羟基化能力海洋真菌，通过 将接种环灭菌，无菌操作挑取保藏于液体石蜡的斜面中的真菌孢子，用划线法接入新制备 种子培养基中；将培养皿倒置于28°c的恒温培养箱中培养，密切观察其生长状况并记录； 培养约2天后，即出现明显的单菌落，继续培养约3?4d，出现分生孢子，用接种环挑取其 中没有污染且生长较好的菌落接种于经过优化的发酵培养基中，放入28°C恒温培养箱中培 养；培养4d后，将底物溶于2% (占发酵液体积）无水乙醇中，投入到转化瓶中，转化48h后 取出，乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，减压蒸馏得浸膏，5mL乙酸乙酯溶解，加入适量粗硅胶 至糊状，减压浓缩至干，进行硅胶柱层析，收集含目标组分的流出液，HPLC确定组分纯度，核 磁分析检测，最终确定化合物结构。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0022] 本发明提供一株新菌株一枝孢霉ZF-35及其生物转化环氧黄体酮制备羟化 环氧黄体酮的方法，即利用微生物转化的方法，以枝孢霉ZF-35经发酵培养获得的含 菌发酵液为酶源，以环氧黄体酮为底物，同时获得了三种羟基化环氧黄体酮：11 α -羟 基-16 α, 17 α-环氧-孕甾-4-稀-3, 20-二酮，6 β -轻基-16 α, 17 α-环氧-孕 甾-4-烯-3, 20-二酮，7 β -羟基-16 α，17 α -环氧-孕留-4-烯-3, 20-二酮，具有一步引 入、专一性强、环境污染小的优点，且操作简单，分离迅速，便于大规模生产应用；羟化环氧 黄体酮可作为留体激素类药物化学合成的先导化合物，对于研宄其新化学合成路径具有重 要的指示作用。由于该微生物转化方法具有作用条件温和，可以在常温、弱酸性、水等环境 中进行，同时具有高效的底物选择性，并且具有分离纯化简单高效等优点，因此在工业生产 性激素和其他留体激素药物的方面，具有很好的应用前景。 (四）
【附图说明】
[0023] 图1为菌株ZF-35菌落形态。
[0024] 图2为菌株ZF-35的显微照片（*800倍）。 (五）
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0026] 实施例1枝孢霉ZF-35的分离鉴定
[0027] 1、初筛
[0028] 制备海水稀释液：取Iml中国东海北炜28. 2690度，东经121. 6047度海域海水加 入盛有9ml无菌水的试管中，以此类推，制成10'10'10'10'KT5不同浓度的海水稀释 液，使用已灭菌的吸管，分别吸取一滴加入到初筛培养基中，使用涂布棒涂匀。将培养皿倒 置于28°C的恒温培养箱中培养2天后，出现菌落，挑取单菌落，通过划线分离法接种至初筛 培养基中，继续培养约2d，出现明显单菌落，挑取单菌落保藏于初筛培养基斜面中，即可获 得菌种。
[0029] 每升初筛培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15?20g，蒸馏水1000mL，pH 为7。
[0030] 2、复筛
[0031] 分别挑取初筛分离纯化获得的菌株投入250mL的锥形瓶中（发酵培养基约50mL)， 放入28°C恒温培养箱中，200rpm培养3d，获得菌体湿重为60g/L发酵液的含菌发酵液。取 50ml含菌发酵液，加入16 α，17 α -环氧黄体酮〇. 〇2g和Iml无水乙醇的混合液，在28°C、 200rpm下进行转化反应，转化2d后，将反应液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减 压蒸干，加入无水甲醇，配成5mg 的甲醇溶液，进行HPLC分析，最终筛选获得底物转化 率高于50%的菌株，记为菌株2?-35。
[0032] HPLC检测条件为：色谱柱：Phenomenex, USA, (5 μπι)，流动相：甲醇-水，流速： 0· 8mL/min，检测波长：254nm。
[0033] 3、生理生化特征
[0034] 菌株菌落绒状到粉末状，颜色呈橄榄绿，反面为橄榄黑色，显微镜下，分生孢子梗 为橄榄棕色，长度不等，一般长为350微米，分生孢子梗末端和外侧可产生支状分生孢子 链，菌株ZF-35形态如图1、图2所示，因此，通过形态观察可初步判定为枝孢霉。
[0035] 4、分子鉴定
[0036] 基因学测定，委托南京金斯瑞有限公司进行测定：以ITSl和ITS4为引物，提取 菌株ZF-35总RNA并反转录成cDNA作为模板，然后通过PCR扩增，PCR纯化，最终获得 近ITS区全序列（核苷酸序列为SEQ ID ΝΟ:1所示），最后通过美国国立生物信息中心 (NCBI)的基因库Genback检索得到菌株ZF-35的ITS全序列与枝孢霉（Cladosporium sphaerospermum)相似度> 99%。
[0037] 引物 ITS1:3，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5，；
[0038] 引物 ITS4:3' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-5，；
[0039] SEQ ID NO ： 1 ：
[0040] CTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTTGAACCCGGCCCTCGGGCCGGGATGTTCACAAC CCTTTGTT