产磷脂酶c的地衣芽孢杆菌及其产生的磷脂酶c的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶脱胶领域，具体说是一种产磷脂酶C的地衣芽孢杆菌及其产生的磷 脂酶C。
【背景技术】
[0002] 磷脂酶（Phospholipase, PL)是生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，水解产物 为各种磷脂酸和氨基醇，如胆胺、胆碱、丝氨酸、乙醇胺等。根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点 不同，可将憐脂酶分为憐脂酶A(Phospholipase A，PLA)、憐脂酶B(Phospholipase B，PLB)、 憐脂酶 C(Phospholipase C，PLC)和憐脂酶 D (Phospholipase D，PLD)，如图 1 所不。
[0003] 磷脂酶可广泛应用于油脂精练、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药等方面。 脱胶是植物油精炼过程中的一个重要环节，对提高油的品质至关重要，脱胶主要是脱除磷 月旨，脱胶若不彻底，会影响油品的深加工和油品的稳定性，减低油品货架期。酶法脱胶可以 克服传统脱胶方法脱胶脱除率低，同时中性油损失高等的问题。而在酶法脱胶工艺中，现有 文献多报道磷脂酶PLA用于植物油脱胶。磷脂酶PLA (包括PLAl和PLA2)，脱胶后可产生极 性溶血磷脂和极性脂肪酸，PLA脱胶工艺仅仅损失油中总的磷脂分子，来减少精炼损耗。而 磷脂酶PLC酶通过选择性水解磷酸酯官能团与磷脂反应，生成甘油二酯（DAG)和磷脂酸基 团，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脱胶工艺通过保留原始的磷脂分子而仅去除磷酸酯 官能团来减少精炼损耗，不存在PLA脱胶工艺中产生的能提高脱胶油酸价的极性脂肪酸的 问题，PLC用于脱胶优势明显好于PLA。
[0004] 磷脂酶C (PLC)可来源于动物和微生物。文献报道磷脂酶C细菌来源的有： 粘质沙雷氏菌武汉株（Serratia marcescens wuhan strain)、假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridum perfringens)、诺氏梭状芽孢杆 菌（Closrtidium novyi)、双酶梭状芽抱杆菌（clostridium bifermantans)、洋葱假单 胞菌（Pseudomonas cepacia)、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus)、錯状芽抱 杆菌（Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)、类鼻疽伯克 氏菌（burkholderia pseudomallei)。憐脂酶C霉菌来源的有：烟曲霉（Aspergillus fumigates)、黄曲霉（Aspergillus flavus)、自佐氏曲霉菌（Aspergillus saitoi)。憐脂 酶C酵母来源的有白色念珠菌（canidia Albicans)。JP50-1017183报道斯谷假单胞菌 (Pseudomonas schuylkilliensis)可以产憐脂酶 C。JP49-55893 报道来源于 streptomyces hachi jyoensis 的憐脂酶 C。
[0005] 磷脂酶C的芽孢杆菌来源相关报道中，蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌来源的 PLC的相关文献和专利报道的比较多，并未有来源于地衣芽孢杆菌的磷脂酶C的相关报道。 US6284517公开了蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌有磷脂酶C活性。JP55034039报道苏云 金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)可以产磷脂酶C。US3909360报道錯样芽孢杆菌产 磷脂酶A和磷脂酶C。
[0006] 蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌是引起水源和食物等污染的常见菌，蜡样芽孢杆 菌可厌氧生长、有运动性、该菌呈长杆状，宽度大于1微米。而有报道的真菌烟曲霉和黄曲 霉来源的磷脂酶C，烟曲霉和黄曲霉也是公认的致病菌，无法在食品工业中使用。
[0007] 地衣芽孢杆菌自身无致病性，而且地衣芽孢杆菌是GRAS (Generally Recognized as Safe，GRAS是美FDA评价食品添加剂的安全性指标）菌株，地衣芽孢杆菌在饲料中的 应用，可直接用作畜禽的复合微生态制剂（CN201010232600. 2)，也可以用于发酵秸杆饲 料（CN201010164201. 7)，提高饲料的蛋白量。地衣芽孢杆菌是一些重要工业酶制剂的生 产菌，地衣芽孢杆菌能够分泌多种酶，其中能够应用到医药领域的酶主要有丝氨酸纤溶性 蛋白酶(纳豆激酶）和脂肪酶两种。我国的豆豉纤溶酶和韩国的大豆发酵食品中分离的 纤溶酶也都是地衣芽孢杆菌分泌的丝氨酸纤溶性蛋白酶的一种。地衣芽孢杆菌可以发酵 生产碱性蛋白酶（CN03144206. 4, CN201110220386. 3)，还可以用于提升白酒酿造的风味 (CN201110233172. X)等等，所以，地衣芽孢杆菌更安全可靠。
[0008] 但目前尚没有发现地衣芽孢杆菌产磷脂酶PLC的报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的在于，提供一种分离的表达磷脂酶C的菌株。
[0010] 本发明提供的分离的表达磷脂酶C的菌株，命名为WBRD01160,保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 7878。
[0011] 本发明还有一个目的在于，提供一种生产磷脂酶C的方法。
[0012] 本发明提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养前述的菌株以使所述菌株或细胞生 产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
[0013] 在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在适宜所述菌株生长和/或适宜所述 菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述培养为在适宜所述菌株生长的条 件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下 培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
[0014] 在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在25-40°C、120-250rpm培养所述菌 株6-24h。
[0015] 在本发明的一个优选实施例中，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外 的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还 包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。
[0016] 本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C。
[0017] 本发明提供的磷脂酶C为用前述方法制得。
[0018] 本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C酶液。
[0019] 本发明提供的磷脂酶C酶液为用前述方法制得。
[0020] 本发明还有一个目的在于，提供一种脱胶的方法。
[0021] 本发明提供的脱胶的方法为使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液进行脱胶，优选 的，所述脱胶为油脂脱胶。
[0022] 本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脱胶 的用途，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
[0023] 本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂 改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
[0024] 本发明的产磷脂酶C的细菌-地衣芽孢杆菌（Bacillus Iicheniformis) WBRD01160及使用该菌株获得的酶液和磷脂酶C可以用于油脂精炼，脱胶效果良好，由于地 衣芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，可以直接用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用 于油脂精炼。同样地衣芽孢杆菌来源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲 料改良剂和医药工业等方面。
【附图说明】
[0025] 图1显示磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D的酶切作用示意图。
[0026] 图2显示地衣芽孢杆菌WBRDOl 160磷脂酶C水解磷脂酰胆碱的TLC检测结果，其 中泳道1为1，2二油酸甘油酯，泳道2为1，3二油酸甘油酯，泳道3为三油酸甘油酯，泳道 4为枯草芽孢杆菌来源粗磷脂酶C酶液水解磷脂酰胆碱后的样品，泳道5为磷脂酰胆碱。
[0027] 图3显示地衣芽孢杆菌WBRDO1160磷脂酶C的最适温度检测结果。
[0028] 图4显示地衣芽孢杆菌WBRDO1160磷脂酶C的最适pH检测结果。
[0029] 图5显示地衣芽孢杆菌WBRDO1160发酵浓缩酶液在不同温度下孵育后酶活检测结 果。
[0030] 图6为地衣芽孢杆菌WBRDOl 160磷脂酶C的pH稳定性曲线。
[0031] 图7显示不同金属离子、柠檬酸和EDTA等对地衣芽孢杆菌磷脂酶C活性的影响。
[0032] 本发明的菌株WBRD01160已于2013年7月4日保藏在"中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心（CGMCC)"（北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No. 7878,分类命名为：地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis0
【具体实施方式】
[0033]