一株产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌utm102 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及发酵领域，具体地，涉及一种携带有植酸酶基因的嗜热地衣芽孢杆菌 菌株UTM102及其降解有机固体废弃物以及制备生物肥料的用途。
【背景技术】
[0002] 在城乡生活和生产的过程中会产生大量的有机固体废弃物。如在城镇生活污水处 理过程中产生大量的污泥，其含大量有害病菌，加之有机物含量丰富，容易腐化发臭造成严 重的二次污染。而农业畜牧业生产过程中的废弃物，如桔杆、畜禽粪便及动物尸体等已成为 严重的污染源，在某些地区已成为第一污染源。
[0003] 城乡有机固体废弃物主要的成分为木质纤维质物质。木质纤维素是由纤维素、半 纤维素与木质素组成的晶体状结构，利用高温堆肥好氧发酵以降解木质纤维素是高效利用 有机固体废弃物的有效方法。利用多种微生物的协同作用，使各种复杂的有机态养分，转化 为可溶性、易吸收的养分和腐殖质。同时堆肥所产生的高温（80?KKTC )杀灭物料中的病 菌、虫卵。通过微生物发酵有机固体废弃物制备生物肥料在发展生态农业中具有重要地位， 不仅解决了废弃物难以处理的问题，同时变害为宝。将具有植酸酶活性，并具有多种耐高温 的生物质水解酶的地衣芽孢杆菌运用于有机固废物料的处理，并制备促生性功能生物肥料 未见报导。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌UTM102菌株及其应 用。
[0005] 本发明从采自自然界温泉底泥，利用驯化培养基（葡萄糖l〇g、牛肉膏3g、酵母提 取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml)在40°C，经多代富集驯化，定向筛选后得 UTM102菌株，它具有降解有机固体废弃物特性。该菌株已于2014年8月13日在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)保藏，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏号为 CGMCC No. 9508。
[0006] 本发明提供的UTM102为革兰氏阳性、细胞0. 8X (2. 0?3. 5)、直杆状、单生、产生 近中生椭圆芽孢，孢囊膨大；在含葡萄糖蛋白胨的培养基上（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母 膏5g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，pH7. 0)菌落光滑正园、稍突、蛋壳黄色、生长迅 速，30?40°C培养24小时后菌落直径约2?3mm，最适生长温度40?60°C。接触酶阳性、 氧化酶阳性、VP实验阳性。
[0007] 利用引物为（27f) :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，测序后获得的序列见序 列表SEQ ID No: 1。将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM102菌株的 该基因与Bacillus Iicheniformis的相似性最高，为99. 3%，此序列是鉴定该菌株的主要 特征依据。
[0008] 利用通用引物UP-1S:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序后的基因序列见序 列表SEQ ID N〇:2。获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比 对，结果显示UTM102菌株的gyrB基因序列与Bacillus Iicheniformis相似性最高，结合 所述菌株的生理生化特性为鉴别该菌株的次要特征。确定该菌株为地衣芽孢杆菌BaciIlus Iicheniformis 0
[0009] 本发明提供了一种地衣芽孢杆菌（Bacillus Iicheniformis)菌株UTM102,其保 藏编号为 CGMCC No. 9508。
[0010] 本发明提供的地衣芽孢杆菌UTM102具有β-葡聚糖内切酶、纤维二糖酶、木聚糖 酶及植酸酶活性，其编码基因见序列表SEQ ID Νο:3?SEQ ID Νο:6。
[0011] 本发明提供了含有地衣芽孢杆菌UTM102的菌剂。
[0012] 本发明提供了地衣芽孢杆菌UTM102或其菌剂在有机固体废弃物的生物降解过程 中的应用。
[0013] 本发明提供了一种制备含地衣芽孢杆菌UTM102的堆肥接种剂的方法，包括以下 步骤：
[0014] (1)制备发酵液：将地衣芽孢杆菌菌株UTM102活化菌种接种于葡萄糖蛋白胨的液 体培养基中，进行发酵生产；
[0015] (2)发酵液分装成为液体菌剂，经脱水干燥得到菌粉剂。
[0016] 上述方法中，步骤（1)从4°C保存的本发明菌株UTM102斜面上取少量菌苔接种至 装有40ml含葡萄糖蛋白胨的培养基（葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、蒸馏 水1000ml，pH7. 0)的250ml三角瓶。培养温度35?40 °C，摇床转速160-220转/分钟，培 养1?2天，OD6tltl大于1. 8时停止培养，此为摇瓶种子液。
[0017] 将摇瓶种子液接种至含葡萄糖蛋白胨的培养基（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏 5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH7. 0)的种子罐中进行培养。培养温度35?40°C，通气量 为1:0. 1?0. 5 (v/v)，搅拌速度为100?400转/分钟，培养时间30?48小时。当OD6tltl 为大于1. 8停止培养，此为种子罐种子液。
[0018] 将种子罐种子液按0. 1?5%接种量，接种含上述培养基的发酵罐中进行发酵培 养。培养温度35?40 °C，通气量为1:0. 2?0. 6 (v/v)，搅拌速度为60?200转/分钟，培 养时间20?40小时。当0D_为大于1. 8时停止培养，此为菌株的发酵液。
[0019] 本发明提供了地衣芽孢杆菌菌株UTM102或含有其的菌剂在有机固体废弃物堆肥 发酵中的应用。
[0020] 所述有机固体废弃物为下水污泥、生活垃圾、作物秸杆、动物尸体或畜禽粪便中的 一种或多种。
[0021] 用地衣芽孢杆菌菌株UTM102或含有其的菌剂对有机固体废弃物进行堆肥的方 法，包括以下步骤：
[0022] (1)将相当于总物料湿重0. 1 %?0. 5%的UTM102或其菌剂接种于有机固体废弃 物中，混合拌匀后进行好氧堆肥发酵；
[0023] (2)用水分调理剂将物料的水分调至含水率为45%?65%，此物料的碳氮比为 10?60:1，堆体保持氧气含量约为8%?15% ;
[0024] (3)堆体发酵12-20天，发酵终止；剩余物料或填埋或焚烧或过筛分装得到生物肥 料。
[0025] 上述堆肥方法中，步骤（2)的发酵进程中最高温达到103?105°C ;步骤（3)经 12-20天的好氧发酵物料水分降至30?35%，废弃物中的大部分有机物被分解，终止发酵。
[0026] 本发明提供了地衣芽孢杆菌菌株UTM102或含有其的菌剂在制备有机肥料中的应 用。
[0027] 本发明提供了地衣芽孢杆菌菌株UTM102或含有其的菌剂在促进植物生长中的应 用。
[0028] 本发明从温泉底泥中分离到一株具有植酸酶、纤维二糖酶、葡聚糖内切酶、木 聚糖酶等活性的菌株，为利用有机固体废弃物制备生物肥料提供了一种兼具农作物促生效 果及降解有机固体废弃物使其减量化无害化特性的微生物。UTM102含有植酸酶，其分泌的 植酸酶能够将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它物质 参与到植物的能量代谢与物质代谢过程中，从而促进植物生长。UTM102菌株可在下水污泥、 生活垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸杆等有机固体废物中进行好氧堆肥发酵，在有机 物料中形成稳定的菌落生态系统，大量快速繁殖，有效地降解有机固体废弃物中的有机物， 使其快速达到减量化、无害化；同时应用本发明所制备的微生物菌剂可将有机固体废弃物 转化成生物肥料，此肥料中含有的大量地衣芽孢杆菌可抑制植物病原菌，对植物生长能够 起到促进作用，可以提高作物的产量。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明菌株UTM102系统进化树。
[0030] 图2为本发明菌株UTM102的显微镜照片。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0032] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0033] 实施例1地衣芽孢杆菌UTM102的分离与鉴定
[0034] 采取1克温泉底泥样品置于装有多粒小玻璃珠及50ml无菌水的250ml三角瓶中， 40°C恒温摇床上震荡1小时，静置30分钟。在无菌条件下吸取上清液lml，接入装有50ml已 灭菌的驯化培养基（葡萄糖l〇g、牛肉膏3g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、IOOOml 蒸馏水）的250ml三角瓶中，40°C培养3天（转速160转/分钟）。用同样方法，再次吸取 Iml富集液，传代培养3代。
[0035] 取培养3代后的菌悬液1ml，加入到9ml无菌水中，按10倍稀释法配制成ΚΓ1，ΚΓ 2， 10_3,10_4,10_5,10_ 6,10_7的稀释度。每个稀释度各取0· Iml涂布于3个含有植酸钙的鉴定 培养基的平板上。取0.1ml的无菌水按同法操作，作对照。40°C培养3天。选择菌落分散 较好的平板，从上挑取降解圈大的单菌落。并在鉴定培养基上，反复划线分离纯化3次，接 种在含葡萄糖蛋白胨琼脂的培养基上（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏5g、氯化钠5g、琼脂 15g、蒸馏水1000ml，pH7. 0)斜面培养至丰厚，在4°C下保存，备用。
[0036] 上述鉴定培养基的配方为：植酸钙0. 1%?0. 5%、葡萄糖3?5%、NH4N03 0. 5? 0· 8%、MnS04 · 4H20 0· 002 ?0· 005%、FeS04 · 7Η200· 003 ?0· 005%、MgS04 · 7H20 0· 03 ? 0.06%、1((：10.03?0.07%、0.04%溴甲酚绿溶液1.5?2.0%卜八）、琼脂1.5?2%， pH5. 0 ?6. 0。
[0037] 以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA基因序列，引物为（27f): 5， -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5， -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。 PCR反应程序为：95°C预变性5分钟，95 °C变性30秒，53 °C退火45秒，72 °C延伸90秒，30 个循环，72°C延伸10分钟。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No: 1 所不。获得的 16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库（http://www. ezbiocloud. net/) 进行比对，与菌株Bacillus Iicheniformis的相似性最高，同源性为99. 3%。图1为基于 UTM102菌株及其相近菌株16S rRNA基因序列，利用Mega5. 0系统进化软件构建的系统进化 树（最大似然法），说明其系统进化关系与地衣芽孢杆菌最近。
[0038] 利用通用引物UP-1S:5'-G