一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因工程菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 四氢啼陡（1，4, 5, 6-tetrahydr〇-2-methyl-4-pyrimidineca;rboxylic acid ; ectoine)是一种在耐盐及嗜盐微生物中应用最为广泛的渗透压调节物。四氢嘧啶分子具有 高度水溶性、不带电荷的特点，在高盐环境下细胞可通过四氢嘧啶的高浓度积累提高胞内 渗透压，却不会影响胞内生物大分子正常的生理功能。研究表明在高盐、高温、冷冻和干燥 等逆境下四氢嘧啶对核酸、蛋白质、细胞膜及整个细胞可提供保护作用，因此在生物制剂、 化妆品生产和制药等领域具有广泛的应用前景。
[0003] 传统的四氢啼陡生产工艺是利用嗜盐细菌延长盐单胞菌（Halomonas elongata) 可以分泌合成四氢啼陡的特性，采用"细菌挤奶（Bacterial milking)"的工艺通过高盐诱 导合成、低盐释放，渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的高效分泌合成。该方法对反应器 材料的稳定性有较高要求，而且这种不连续的生产流程及高浓度的盐增加了下游纯化工艺 的难度，另外高浓度的盐易对设备造成腐蚀，同时还会影响菌体的生长，影响四氢嘧啶的产 量，导致生产成本的增加，影响了四氢嘧啶的大规模应用。
[0004] 目前现有的生产菌株及方法严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因 此开发一株新型的四氢嘧啶高产菌株从而简化生产工艺、提高合成效率、降低生产成本，对 四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌。
[0006] 本发明提供的大肠杆菌工程菌具体为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段 的重组大肠杆菌或重组载体：
[0007] 1)序列表中SEQ ID Ns :1所示的核苷酸序列；
[0008] 2)编码序列表中SEQ ID Ns :2、SEQ ID Ns :3和/或SEQ ID Ns :4所示蛋白质序列 的多核苷酸序列；
[0009] 3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序 列；
[0010] 4)与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以 上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0011] 所述重组大肠杆菌具体为将所述重组载体导入出发大肠杆菌后得到的重组菌。
[0012] 所述重组载体具体为在出发载体pBAD/HisA的多克隆位点插入具有SEQ ID Ns :1 所示核酸序列的DNA片段所得的质粒；所述出发大肠杆菌具体为大肠杆菌；具体的，所述出 发大肠杆菌为带有AaraBAD阿拉伯糖代谢缺陷性状的大肠杆菌；再具体的，所述出发大肠 杆菌为大肠杆菌 BW25113 (rrnB3 Λ lacZ4787hsdR514 Λ (araBAD) 567 Λ (rhaBAD) 568rph-l)。
[0013] 所述重组载体具体为pBAD-EctABC，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID Ns . 5所 /Jn 〇
[0014] 所述重组大肠杆菌具体为大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC CGMCC NO. 8334〇
[0015] 本发明的另一个目的是提供上述任一所述的重组大肠杆菌或重组载体在制备四 氢嘧啶中的应用。
[0016] 本发明的还一个目的是提供一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠 的溶液中加入上述任一所述的重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠 杆菌是表达了经过诱导表达SEQ ID Ns :2所示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4 所示蛋白的。
[0017] 所述诱导包括用L-阿拉伯糖进行诱导。
[0018] 所述诱导包括用含lg/L的L-阿拉伯糖的发酵液进行诱导；和/或，所述诱导前， 菌体溶液的0D600值为0. 6-0. 8 ;和/或，所述诱导时，发酵条件为30°C培养6-8小时；优选 的，培养6小时。
[0019] 所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸 钠的溶液中的浓度如下：
[0020] L-天冬M酸钠 200m\f； 葡萄糖 l〇g/L; IH由 l〇g/L; KCl 10g/L；
[0021] 溶剂为lOOmM、ρΗ7· 0的PBS缓冲液。
[0022] 所述lOOmM、ρΗ7. 0的PBS缓冲液是由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成的，具体 为，每IL所述ρΗ7. 0的PBS缓冲液由380ml0. IM磷酸二氢钠水溶液加入620ml0. IM磷酸氢 二钠水溶液配制而成。
[0023] 所述生物转化反应的反应条件为30°C ;和/或，在加入权利要求1-4任一所述的 重组大肠杆菌后，可调节菌体溶液〇D_值达到10。
[0024] 所述生物转化反应后，还需进行胞内和/或胞外四氢嘧啶的抽提；
[0025] 所述胞内四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集菌体后冻干，将冻干菌 体加入体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、水组成的抽提液中震荡1小时，离心取上清，上清液 中加入等体积的氯仿与水的混合液，氯仿与水的体积比为1:1，振荡1小时，离心取上层水 相，干燥除水后即得；
[0026] 所述胞外四氢嘧啶的抽提包括：生物转化反应后，离心收集液相，加入等体积氯仿 振荡1小时，离心取上清，移除溶剂后即得。
[0027] 本发明的再一个目的是提供一种利用上述任一所述的重组大肠杆菌制备四氢嘧 啶的生物反应液，其组成包括：
[0028] Ir 舊9ΛΜ 200m?; 葡·唐 l〇g/U Irtt 丨 Og/L; KCl !Og/L；
[0029] 溶剂为lOOmM、ρΗ7· O的PBS缓冲液。
[0030] 所述lOOmM、pH7. O的PBS缓冲液是由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成的，具体 为，每IL所述pH7. 0的PBS缓冲液由380ml0. IM磷酸二氢钠水溶液加入620ml0. IM磷酸氢 二钠水溶液配制而成。
[0031] 为了避免传统生产方法的缺陷，本发明将嗜盐菌来源的四氢嘧啶合成基因簇导入 非嗜盐微生物大肠杆菌中，重构四氢嘧啶的合成通路。本发明成功构建了延长盐单胞菌 Halomonas elongate四氢啼陡合成基因簇EctABC的大肠杆菌表达载体pBAD-EctABC及 K-12系列重组表达菌株BW-pBAD-ectABC。其中四氢嘧啶合成中的三个关键酶：氨基丁酸 乙酰基转移酶（EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶（EctB)、四氢嘧啶合成酶（EctC)，在阿拉伯 糖启动子的调控下均实现了可溶性表达。诱导表达后的菌体以天冬氨酸钠为前体通过生物 转化的方法实现了四氢嘧啶的高效分泌型合成。每克菌体可以合成1. 1克四氢嘧啶，其中 超过90 %的四氢嘧啶分泌至胞外。
[0032] 本发明首次利用延长盐单胞菌Halomonas elongate四氢啼陡合成基因簇EctABC 实现了四氢嘧啶在大肠杆菌中的高效分泌合成，结合以L-天门冬氨酸钠为催化底物的生 物转化方法，单位菌体的四氢嘧啶合成效率显著高于其它现有菌株，合成量达到已报道的 最高水平，且绝大部分产物分泌至胞外，便于产物的下游纯化分离。因此本发明对四氢嘧啶 的工业化生产和大规模应用具有重大意义。
【附图说明】
[0033] 图1为SDS-PAGE分析四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达情况。
[0034] 图2为大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中四氢嘧啶合成水平的分析。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 延长盐单胞菌Halomonas elongate CGMCC No. 1. 6329购自中国普通微生物菌种 保藏管理中心（CGMCC)。
[0038] pBAD/HisA 购自 invitrogen，产品目录号为 V430-01 ;
[0039] 实施例1、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的构建 [0040](一）、四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达
[0041] I、PCR扩增四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码序列
[0042] 以延长盐单胞菌H.elongate(CGMCC No. 1.6329)的基因组DNA为模板，用引物 EctABC-Pl、EctABC-P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0043] EctABC-Pl :5' ~CCTAGCTAGCATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTA~3,
[0044] EctABC-P2 :5' -CCGCTGCAGTTACAGCGGCTTCTGGTCGTCGGCT-3'
[0045] 2、酶切、连接
[0046] 用NheI和PstI双酶切PCR扩增产物，与预先使用NheI和PstI双酶切的pBAD/ HisA质粒大片段进行连接，得到重组质粒。
[0047] 3、转化、筛选以及序列验证
[0048] 用氯化钙化学转化法将上述制备的重组质粒转化至大肠杆菌DH5ci，用含有氨苄 青霉素（100 μ g/ml)的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养和提取质粒， 进行测序验证。测序结果表明，上述制备的重组质粒中含有具有如序列表中的SEQ IDNs. 1 所示核酸序列（即EctABC编码基因序列）的DNA片段，该序列分别编码具有序列表中SEQ ID N2 . 2-4所示氨基酸序列的3种蛋白（即四氢嘧啶合成中的三个关键酶：氨基丁酸乙酰基 转移酶EctA、二氨基丁酸氨基转移酶EctB、四氢嘧啶合成酶EctC)，与已报道的序列一致。 上述实验过程及结果证明构建的质粒及重组菌正确。将阳性克隆记作DH5 a -pBAD-ectABC， 阳性质粒记作pBAD-EctABC。质粒pBAD-EctABC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID Ns . 5 所示。
[0049] 4、重组表达菌株的构建
[0050] 用氯化钙化学转化法将重组质粒pBAD-EctABC转化至大肠杆菌K-12系列表达菌 株 BW25113(rrnB3 ΛlacZ4787hsdR514 Λ (araBAD)567 Λ (rhaBAD)568rph-l)(购自 Thermo Cat#0EC5042)，用含有氨苄青霉素（100 μ g/ml)的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，获 得EctABC重组表达菌株。检测重组菌株合成四氢嘧啶的能力，将其中合成能力较差的一株 重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli)