一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞培养领域，涉及一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血 清培养基以及相应的培养神经干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 神经干细胞（NSC)是一类能够自我复制的多潜能干细胞，在一定条件下能够分化 成神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。因其具有治疗多种神经系统疾病的潜能，目前在 国际临床试验注册网站上注册的神经干细胞治疗项目已达近900项，主要用于脑瘫，脑中 风（脑梗死、脑出血）后遗症、脊髓损伤、运动神经元病、小脑萎缩、共济推敲、帕金森病、视 神经萎缩、老年痴呆等多种疾病的治疗。伴随着神经干细胞治疗技术的高速发展，开发一种 符合临床使用要求且有快速大量扩增神经干细胞的培养基至关重要。
[0003] 目前市场上人神经干细胞无血清培养基有较多缺陷，较难用于人神经干细胞规模 化生产及临床应用。1、商业化培养基仍含有少量动物源性成份，其具有潜在的病毒感染风 险；2、商业化培养基批间差异较大，在前期试验中，我们使用不同批次的目前最好的商业化 培养基StemPro NSC SFM贴壁培养胎儿源性的神经干细胞，所培养细胞增殖效率及其鉴定 结果表达S0X2等神经干细胞表面标志物差异较大，难于保证所培养干细胞质量；3、此类培 养基不具有符合要求的质量标准及检测报告，达不到临床使用要求；4、所培养神经干细胞 增殖较慢，难于将来源限制较大的人神经干细胞扩增至足够临床使用的数量；5、该类培养 基多适用于神经干细胞悬浮培养，贴壁将导致细胞分化，然而悬浮培养中细胞增殖较慢且 培养过程中神经球内部细胞难于得到均匀的营养供应而易衰老或分化，而最终导致细胞存 活率及细胞纯度均较低；6、价格较高，限制了神经干细胞规模化生产及应用。
[0004] 本发明针对以上目前商业培养基中存在的缺陷，完全去除培养基中动物源成分， 以重组植物源蛋白和植物源因子取代动物源或人源，并摸索了其使用浓度。最终研制出一 种可贴壁培养人神经干细胞的培养基并制订了相关质量标准（草案）及检测方法，用本发 明所述培养基贴壁培养人胎儿源神经干细胞，与目前同类商业化培养基相比，能够更快速 纯化、扩增人神经干细胞并维持其神经干细胞特性，价格较低，适合干细胞规模化制备及临 床应用。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是解决现有无血清神经干细胞培养基所存在的问题，提供一种可用于 贴壁培养人神经干细胞的无血清培养基。
[0006] 本发明所述的用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基包括：基础培 养基、基础营养添加剂、植物源人血清白蛋白、糖类、脂类、激素、抗氧化剂、促代谢相关物 质；其中，所述基础培养基是由商品化的DMEM/F12与商品化的neurobasal培养基按1:1 的比例配制而成；所述基础营养添加剂包括：胰岛素、含铁转铁蛋白、脱铁转铁蛋白、腐胺、 孕酮、亚硒酸钠；所述激素包括：生物素、皮质酮、硫辛酸、Ve及Ve醋酸酯；所述抗氧化剂 包括：人源过氧化氢酶、人源超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、Vc ;所述促代谢相关物质包括：肉 碱、T3、乙醇胺。
[0007] 根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述培养基的成份及其含量如 下：植物源人血清白蛋白：1〇〇 - 3000μ g/ml ;胰岛素：4 一 3〇μ g/ml ;含铁转铁蛋白：5 - 100 μ g/ml ;脱铁转铁蛋白：1 - 5 μ g/ml ;腐胺：10 - 20 μ g/ml ;孕酮：0· 005 - 0· 010 μ g/ 1111;亚硒酸钠：0.005 - 0.01(^8/1111;0-半乳糖：1 - 2(^8/1111;脂类：1%;生物素：0.1 - 0· 5 μ g/ml ;皮质酮：0· 01 - 0· 08 μ g/ml ;硫辛酸：0· 01 - 0· 10 μ g/ml ;VE :1 - 10 μ g/ml ; VE醋酸酯：1 一 10 μ g/ml ;人源过氧化氢酶：1 一 10U/ml ;人源超氧化物歧化酶：0. 1 - IU/ ml ;谷胱甘肽（抑制）1 - 10 μ g/ml ;Vc :1 - 10 μ g/ml ;L -肉碱：1 - 10 μ g/ml ;乙醇胺： 1 一 10 μ g/ml ;三碘甲状腺原氨酸（T3) :0· 001 - 0· 010 μ g/ml ;植物源人 bFGF 20 - 50ng/ ml ;植物源人EGF 20 - 50ng/ml ;谷氨酰胺：1%。
[0008] 优选地，所述培养基的成份及其含量如下：植物源人血清白蛋白：250 μ g/ml ;胰 岛素：25 μ g/ml ;含铁转铁蛋白：100 μ g/ml ;脱铁转铁蛋白：2. 3 μ g/ml ;腐胺：16. 1 μ g/ ml ;孕酮：0· 0063μ g/ml ;亚硒酸钠：0· 0052μ g/ml ;D -半乳糖：15μ g/ml ;脂类：1 % ; 生物素：〇· I μ g/ml ;皮质酮：0· 02 μ g/ml ;硫辛酸：0· 047 μ g/ml ;VE :1 μ g/ml ;VE 醋酸 酯：lμg/ml;人源过氧化氢酶：5U/ml ;人源超氧化物歧化酶：0.4U/ml;谷胱甘肽（抑 制）I μ g/ml ;VC :1 μ g/ml ;L -肉碱：2 μ g/ml ;乙醇胺：1 μ g/ml ;三碘甲状腺原氨酸（T3): 0· 002μ g/ml ;植物源人 bFGF 25ng/ml ;植物源人 EGF 25ng/ml ;谷氨酰胺：1%。
[0009] 根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述植物源人血清白蛋白是来源 于转基因植物，其浓度为100 - 3000 μ g/ml。
[0010] 优选地，所述植物源人bFGF和植物源人EGF均来源于转基因植物，其浓度均为 20 - 50ng/ml 〇 toon] 根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述含铁转铁蛋白与脱铁转铁 蛋白是共同使用的，含铁转铁蛋白的浓度为5 - 100μ g/ml，脱铁转铁蛋白的浓度为1 一 5 μ g/ml〇
[0012] 根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述人源过氧化物酶的浓度为 1 一 10U/ml、人源超氧化物歧化酶的浓度为0. 1 - lU/ml。
[0013] 本发明还提供了一种培养神经干细胞的方法。
[0014] 本发明所述的培养神经干细胞的方法，包括以下步骤：提供如本发明所述的用于 贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基；将神经干细胞在所述培养基中进行贴壁培 养、悬浮培养或悬浮一贴壁交替进行培养。
[0015] 根据本发明所述的培养神经干细胞的方法的进一步特征，当进行贴壁培养时，先 用促使干细胞贴壁的材料包被培养皿，依次加入所述无血清培养基及干细胞；所述促使干 细胞贴壁的材料是选自：Matrigel、明胶、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白中的一种或 一种以上的组合。
[0016] 本发明所述的无血清培养基是通过以下方法得到的：
[0017] 首先，筛选出各文献报导的血清成份及其它可能对神经干细胞生长有良好作用的 30多种细胞因子，以N2为基础添加剂，往其中加入高中低浓度的各细胞因子进行细胞培 养，以单独N2为对照。细胞培养后分别检测各因子对细胞增殖速度、形态及传代后增殖能 力的影响（即培养基对神经干细胞干性维持情况）。结果筛选出对细胞增殖有促进作用且 对神经干细胞诱导分化作用不明显的细胞因子十几种。
[0018] 其次，对各因子根据文献报导浓度设计高低两个浓度，采用Plackett