一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物酶的纯化方法，特别涉及一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法。
【背景技术】
[0002]Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌{Thermus aquaticus) yTl株分离提取的。所述yTl株是一种嗜热真细菌，能在70?75°C生长，该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。Tag DNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94 KDa，75?80 1:时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70 °C延伸率大于60个核苷酸/秒，Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。
[0003]Taq DNA聚合酶作为分子生物学的工具酶，应用十分广泛，具有较高的市场价值，但国内的厂家在生产过程中始终不能克服大规模放大生产的技术难题，究其原因是因为纯化工艺比较繁琐，而且纯化过程中所需柱上步骤比较多，使得国内很多厂家在生产能力上不如国外大公司。
[0004]1993年Frances C.Lawyer等人米用肝素柱对DNA聚合酶进行纯化,肝素柱虽然特异性比较高，但是载量比较低，不利于放大生产。1994年Harrel I和Hart报导的TaqDNA聚合酶纯化方法中提到了用离子交换的方法，1995年Edith Grim报道DNA聚合酶纯化方法中也包含了离子交换的方法。在此以后的大多数关于DNA聚合酶纯化方法的文章中也都采用了离子交换的工艺，但是离子交换的工艺虽然能提高载量，但是由于他本身的洗脱特性会导致其杂蛋白的含量会增多，如果达到一定的纯度要求还需进行其他步骤的纯化，这会增加工艺的复杂度以及提高成本。鉴于此，开发简便、快速、高效、低成本的工业化可行的Taq DNA聚合酶纯化方法是十分必要的。
【发明内容】
[0005]鉴于此，我们针对含有6个组氨酸标签的重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶，开发了一种简便、高效的纯化方法，具有纯度、比活与NEB公司Taq DNA聚合酶的完全一致，收率高、生产成本低，有利于工业化生产的特点。
[0006]本发明采用以下的技术方案:
一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法，由以下步骤组成:
(为避免外源核酸酶的污染，所有缓冲液、接触样品的容器、吸头等物品需要高压灭菌，色谱系统的管路，金属螯合层析柱需要4?6 M盐酸胍处理Ih以上。
[0007](I)破菌离心获得表达重组大肠杆菌DNA聚合酶的菌体，以1: 5?20比例加入破菌缓冲液，搅拌10?20 min使之混合均匀，通过超声或高压均质的方法裂解菌体，使之破碎；其中破菌缓冲液为20?50 mM Tris-HCl，pH7.5?8.5，0.1?5 mM EDTA，0.1?IM KCl，0.1-1% Tween-20,0.1-1% NP-40，溶菌酶 0.5 ?2 mg/ml，加入 PMSF 至 0.02 ?ImM。破菌时以菌液不再粘稠、流动性良好为准。破菌液10000?20000 g离心，时间10?20 min，离心温度控制在O?10 °C。
[0008]所述破菌步骤中破菌法选自高压均质法，是指将菌体和破菌缓冲液的混合液放入高压均质机中，在O?10 °C、工作压力为500?800 bar时均质2?3遍。所述破菌步骤也可以采用超声法，方法为放入超声设备中，超声5?10 S，停10?20 S，共超声10?20min，此超声方法建议体积小于0.5 L时使用。
[0009]2)热处理先将水浴锅加热到70?90 °C，将破菌离心上清液装入一玻璃容器中一并放入预先加热好的水浴锅中，在加热升温过程需不停的搅拌上清液，避免容器内局部温度过高，从而影响酶的活性。热处理时间是20?60 min,当破菌上清液温度达到70?90°C时开始计时。热处理后会有很多不耐热蛋白变性析出，将其放入4 °C冰箱中降至室温以下后方可进行离心，否则温度过高会导致离心杯变形。离心力控制在10000?20000貧，时间10?20 min，温度O?10 °C。
[0010]3)盐析盐析的饱和度为40?60%，经研究40%以上盐析浓度，导致目的蛋白收率轻微下降，对后续纯化纯度没有影响。具体操作为:事先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中一次性加入，搅拌至完全溶解，确保不会出现局部浓度过高，100 ml破菌上清液加入22.6?36.1 g硫酸铵，沉淀温度控制在O?10 °C，沉淀时间为大于2 h，10000?20000貧离心时间10?20 min，离心温度控制在O?10 °C，离心沉淀按金属螯合层析每批处理量分装并冷冻保存。
[0011]4)金属螯合层析金属螯合层析用缓冲液I平衡色谱柱3?5 CV，上样后冲洗约5?10 CV，UV280洗至基线，从缓冲液I到缓冲液II梯度洗脱目的蛋白5?25 CV/5?25 min,收集UV280大于100 mAu组分。其中缓冲液I为20?50 mM Tris-HCl, pH7.0?8.0，0.5 ?I M NaCl，5 ?10 mM 咪唑；缓冲液 II 为 20 ?50 mM Tris-HCl, ρΗ7.0 ?8.0，0.5?I M NaCl，300?600 mM咪唑。通过优化缓冲液成分和洗脱方法，实现了目的蛋白与杂质最大程度的分离。
[0012]所述金属螯合亲和层析步骤中介质配基为亚氨基二乙酸或次氮基三乙酸，优选为亚氨基二乙酸。由于次氮基三乙酸的载量相对较低，所以使用亚氨基二乙酸更经济。GE公司生产的Ni Sepharose HP、Ni Sepharose FF可重复使用,Ni离子脱落较少,选择性高,广泛用于组氨酸标签蛋白的纯化，其中Ni Sepharose HP填料颗粒平均34 μ m,分辨率略高于Ni Sepharose FF,且流速反压与Ni Sepharose FF无明显差异,对纯度要求较高时使用NiSepharose HP较理想,反之使用Ni Sepharose FF即可，同时可以降低成本。
[0013]所述金属螯合亲和层析步骤中柱高为2.5?15 cm，柱床过高，柱压上升明显，影响上样、洗脱流速，过低影响分离效果；上样线性流速为30?120 cm/h,优选为60?100 cm/h，这样可以确保蛋白与填料的充分吸附；洗脱线性流速为100?300 cm/h，优选为100?150 cm/h，上样、洗脱时色谱柱压力控制在0.4 MPa以下，防止色谱柱床压塌；上样量为每ml填料上样菌体蛋白100?300 mg (Bradford法检测),优选为100?200 mg,上样量过高会降低分辨率，目的蛋白穿透，收率降低。
[0014]5)质检、制剂及分装金属螯合层析收集样品，加入等体积甘油-20 °C暂时保存，Bradford法检测蛋白浓度，利用NEB公司的Taq DNA聚合酶活测定方法检测蛋白活性，计算比活，按照NEB公司的Tac1 DNA聚合酶的DNA内切酶检测方法对我们的终产品进行检测。SDS-PAGE检测蛋白纯度。
[0015]在百级层流下，根据需要的酶活性加入稀释缓冲液进行蛋白浓度稀释，稀释缓冲液为I倍的NEB公司的酶储液缓冲液，成分为20 mM Tris-HCl (pH8.0, 25°C )，100 mMKC1，0.1 mM EDTA, I mM DTT,0.5% Tween20,0.5% NP-40，50%甘油。稀释过程中温度维持在O ?10。。。
[0016]稀释样品0.22 Mffl无菌滤膜过滤，无菌连续分液器在百级层流下进行分装。分装过程中温度维持在O?10 °C。分装用离心管经灭菌处理，样品-20 °C冻存。
【附图说明】
[0017]图1 Taq DNA聚合酶Ni柱亲和层析色谱图；
图2.TaqDNA聚合酶破菌、热处理、金属螯合层析SDS-PAGE电泳；
图3 Taq内切酶检测结果。
【具体实施方式】
[0018]本发明所述目的基因来源于:水生热栖菌iThermus aquaticus')
1)目的基因获得:
使用上下游引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因片段。
[0019]上游引物:5’ -GACAAAGCCATATGCGTGGTATGCTGCCG-3 ’
下游引物:5’ -GTACATGGATCCTCATTCTTTCGCAGA-3’
2)构建方法:
2.1使用上下游引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因片段；
2.2使用Nde I及BamH I双酶切目的基因片段及pET15b质粒载体；
2.3连接载体及目的基因、转入大肠杆菌DH5 α菌株；
2.4测序正确后提取质粒转入表达载体大肠杆菌BL21 (DE3)进行诱导表达，表达成功后进行大规模发酵。
[0020]3)发酵过程大肠杆菌BL21 (DE3) pET15b菌种发酵采用三级发酵一级种子培养基(LB):蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠0.5%
氨苄青霉素0.1 mg/ml 原始菌种接种过夜培养培养条件:温度为37 °C, 220 rpm 二级种子培养基(LB)
蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠0.5%，氨苄青霉素0.1 mg/ml 1%-10%接种培养至ODfm为0.5-1.0 培养条件:温度为37 °C, 220 rpm
发酵培养基:胰蛋白胨1.6%，酵母粉1.0%，氯化钠0.5%，三水磷酸氢二钾1.4%，磷酸二氢钾0.52%
补料成分:
酵母粉3%，胰蛋白胨6%，葡萄糖40%，NaCl0.5%
按5%?10%接种，温度为37 V，pH控制在7.0，通过搅拌，通气和灌压控制溶氧保持在30%?60%，后期通过补料控制溶氧保持在30%?60%，当OD-为10?20开始诱导，力口入IPTG至终浓度为0.2?0.5 mM，诱导时间3?5 h，诱导温度为37 °C，可获得发酵液，在5000 rpm离心20 min,收获菌体180?250 g。
[0021 ] 结合具体实施例进行说明。
[0022]实施例1
3 L发酵液离心获得150 g菌体，操作温度为4 °C，加入破菌缓冲液750 ml (菌体和破菌缓冲液的比例为1:5)，其中破菌缓冲液为20 mM Tris-HCl，pH7.5、0.1 mM EDTA、0.5 MNaCl、溶菌酶0.5 mg/ml,0.02 mM PMSF，搅拌10 min使之混合均匀，通过高压均质的方法裂解菌体，即将混合液体在600 bar, 4 °C下勻质2遍,使之不再粘稠；在10000 ?和10。(^下离心10 min,获得950 ml破菌清液。
[0023]将破菌上清液装入玻璃烧杯内，放入预先加热好的水浴锅内，用玻璃棒不停搅拌破菌上清使其温度均匀，用温度计实时检测其温度变化，待破菌上清中温度达到80 V以上时开始计时，在80 °C的条件下处理30 min。而后把破菌上清放入4 °C冰箱中，待其降到室温以下后在10000 g和10 °C下离心10 min，获得920 ml热处理上清。
[0024]事先将267 g硫酸铵用研钵研碎，向热处理上清液一次性全部加入(50%饱和度)，搅拌至完全溶解，沉淀淀温度控制在4 °C，沉淀时间为2 h，10000 g离心，时间15 min，离心温度控制在4 °C。离心获得的盐析沉淀铵等分5份，每份相当约30 g菌体来源的蛋白量，-20 1:长期冻存，盐析收率为95%。
[0025]金属螯合层析的介质配基是Ni2+-1DA,为GE公司生产的Ni Sepharose HP 5 ml(2*2.5 cm)，金属螯合层析用