一种从人凝血因子Ⅸ层析废液中激活制备人凝血酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体为一种从人凝血因子IX层析废液中激活制备人凝 血酶的方法。
【背景技术】
[0002] 人凝血酶是一种快速止血药，由人凝血酶原（人凝血因子II)激活而来，凝血酶本 身适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血；用于外伤、手术、 口腔、耳鼻喉、泌尿、烧伤、骨科等出血的止血，既可以单独成药，也可和人纤维蛋白原组合 成人纤维蛋白胶。
[0003] 人凝血酶的生产工艺方面的研究主要有：Philip K?等：A novel one-step purification of human a -thrombin after direct activation of crude prothrombin enriched from plasma，Biochem，J. (1991)280,805-808,作者同样以人血楽为原料，经 BaC12吸附，（NH4)2S04沉淀，得到粗品人凝血酶原后，用太攀蛇蛇毒作激活剂，激活 人凝血酶原成为凝血酶，然后经过Heparin Sepharose CL6B肝素亲和层析，获得人凝血 酶；钟峻等：高纯度人凝血酶的制备，中国医学科学院学报，1995年第17卷第1期36-40 页报道了人凝血酶的制备方法。作者以人血浆为原料，经BaC12吸附，（NH4)2S04沉淀， 得到粗品人凝血酶原后，用人脑粉作激活剂，激活人凝血酶原酶原成为凝血酶，然后 经过Amberllte CG-50、SP-Sephadex C-50两次离子交换层析，得到电泳纯、比活性可达 2000NIH U/mg 的人凝血酶。Kingdom et al. U.S. Pat. No. 5,354,682 (1994)公开了一种 以人去冷沉淀血楽为原料，经DEAE-Agarose或DEAE-Sepharose凝胶吸附，然后用从兔脑 中提取的促凝血酶原激酶激活人凝血酶原为人凝血酶，S/D灭活后，使用S-S印harose层析 + 反向层析纯化获得人凝血酶。Metzner et al. U.S.Pat.No. US8,012,728 B2 (2011)公 开了一种以粗纯或者中纯人凝血酶(不加入thromboplastin作为激活剂，但未公开具体的 激活方式）为原料，经疏水层析，病毒灭活，还可以加上/或者不加阳离子交换层析，获得高 纯人凝血酶的方法。
[0004] -方面，传统的激活方式一般是以促凝血酶原激酶（Thromboplastin, -般为动 物脑组织或其他组织提取物或者人脑粉等）或者蛇毒作为激活剂，即使经过后续的纯化， 仍无法避免成品中含有核酸或者动物源蛋白及核酸等，仍存在一定的安全隐患。另一方 面，由于人凝血酶原是国内治疗乙型血友病的特效药人凝血酶原复合物（Prothrombin Concentration Complex, PCC)的组成成分之一，两种产品无法同时制备，所以国内临床基 本无人凝血酶的应用。随着国内纯化技术的逐步提高，目前国内已有厂家在进行从PCC中 分离纯化人凝血因子IX的研究，以代替PCC治疗乙型血友病，在此过程中，人凝血酶原在层 析废液中作为杂质蛋白被废弃，十分可惜。由于人凝血因子IX层析流穿液中已基本不含人 凝血因子IX，人凝血酶原的激活途径被打破，很难被激活为人凝血酶。而且，人凝血酶对比 动物源凝血酶的最大优势就是不含动物蛋白质及核酸等。因此本发明提供了一种能综合利 用血浆资源，将人凝血因子IX层析废液变废为宝，不引入动物源物质，激活制备人凝血酶的 方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从人凝血因子IX层析废液中激活制备人凝血酶的方 法。
[0006] 本发明的技术方案为： 一种从人凝血因子IX层析废液中激活制备人凝血酶的方法，包含以下步骤： (1)层析废液激活 将人凝血因子IX层析废液中加入1%-10%PCC，1%-5%人凝血因子VIL 10-30mmol/L CaCl2,10-30°C孵放1-6小时，进行激活，激活前后人凝血酶活性/人凝血酶原活性比例为 100-150。
[0007] (2)凝血酶纯化 将上步骤所得激活后的溶液过Heparin亲和凝胶进行吸附，以0. 1-0. 5mol/L枸 橼酸钠，〇. 1-0. 5mol/L氯化钠溶液pH7. 0±0. 5洗脱获得人凝血酶，人凝血酶比活性达 1000-2000IU/mg。
[0008] (3)冻干及干热 将上步骤中洗脱液超滤透析至电导率5-30mS/cm，pH7. 0±0. 5,冻干；冻干结束后进行 100°C干热灭活30分钟，获得凝血酶产品。
[0009] 本发明的从人凝血因子IX层析废液中激活制备人凝血酶的方法，是将获得人凝血 因子IX产品后的层析废液中，进行后续处理而得到。
[0010] 对于本发明中获得人凝血因子IX产品后的层析废液的步骤如下： a. 获得PCC粗品 将人血浆调整pH至7. 0±0· 5,按1-1. 5g/L比例加入DEAE S印hadex A-50凝胶，吸附 30-60分钟；以10-30mmol/L枸橼酸钠，100-200mmol/L氯化钠溶液，pH7. 0±0. 5洗涤杂蛋 白，以10-30mmol/L枸橼酸钠，l-2mol/L氯化钠溶液，pH7. 0±0. 5洗脱，洗脱液经超滤脱盐 至电导率10-30mS/cm，即为PCC粗品； b. S/D病毒灭活 将步骤a所得PCC粗品中按1 :9比例加入S/D试剂，24土 1°C，孵放360min，灭活脂包 膜病毒； c. 获得人凝血因子IX产品及其层析废液 将步骤b所得病毒灭活后PCC粗品过Heparin亲和凝胶进行层析吸附，以0. 1-0. 5mol/ L枸橼酸钠，0. 5-lmol/L氯化钠溶液pH7. 0±0. 5洗脱获得人凝血因子IX产品，产生的废液 即层析废液。
[0011] 作为优选， 步骤a中DEAE Sephadex A-50应在溶胀及平衡后使用，溶胀参照说明书进行，平衡液 为 10-30mmol/L 枸橼酸钠，50-80mmol/L 氯化钠溶液，pH7. 0±0. 5。
[0012] 步骤a中超滤脱盐的同时进行浓缩，所得的PCC粗品中凝血酶原的活性为 10-30IU/ml〇
[0013] 步骤b中的S/D试剂可为Tween-80/TnBP或者Triton X-100/TnBP，使用前进行预 配，预配浓度为l〇%/3% (w/v)。
[0014] 步骤 c 与步骤⑵中的 Heparin 亲和凝胶为 Heparin Sepharose FF、Heparin Sepharose 6FF、Heparin Sepharose CL6B、CaptoHeparin、AF-Heparin HC-650M、Heparin Hyper D等Heparin亲和凝胶中的任意一种。
[0015] 步骤c中层析废液可以为层析流穿液、层析洗涤液、层析高盐处理液中的一种或 者任意几种的组合。
[0016] 步骤1中的人凝血因子VIL可以为人凝血因子VDI成品，也可为人凝血因子VDI干热 灭活前的半成品，优选干热灭活前的半成品。
[0017] PCC应为人凝血酶原复合物，可以为PCC成品，也可以为步骤a中获得PCC粗品，优 选PCC粗品。
[0018] 步骤1中PCC加入比例（1%-10%)为加入的总凝血酶原活性/步骤3所得废液总凝 血酶原活性；人凝血因子VDI的加入比例（1%_5%)为加入的总人凝血因子VDI活性/步骤3所 得废液总凝血酶原活性。