一种利用ctab提取土壤微生物基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的 方法。
【背景技术】
[0002] 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物，个体微小，结构简单，通常要用光 学显微镜和电子显微镜放大约1000倍才能看到，土壤中微生物的种类较多，有细菌、真菌、 放线菌、藻类和原生动物等。数量也很大，1克土壤中就有几亿到几百亿个。大部分土壤微 生物对作物生长发育是有益的，它们对土壤的形成发育、物质循环和肥力演变等均有重大 影响。
[0003] 首先，土壤微生物可以形成土壤结构。土壤并不是单纯的土壤颗粒和化肥的简单 结合，作为土壤的活跃组成分，土壤微生物在自己的生活过程中，通过代谢活动的氧气和 二氧化碳的交换，以及分泌的有机酸等有助于土壤粒子形成大的团粒结构，最终形成真正 意义上的土壤。土壤微生物的区系组成、生物量及其生命活动对土壤的形成和发育有密切 关系。其次，土壤微生物最显著的成效就是分解有机质，比如作物的残根败叶和施入土壤中 的有机肥料等，只有经过土壤微生物的作用，才能腐烂分解，释放出营养元素，供作物利用， 并形成腐殖质，改善土壤的结构和耕性。正是由于土壤中含有的腐殖质、重金属、多糖类、多 酚类等物质造成了土壤微生物基因组DNA提取困难，腐殖质由于具有与DNA类似的性质，因 此可以在DNA常规抽提中与DNA共沉淀，腐殖质极少量的存在就可以强烈地抑制PCR反应。
[0004] 因此需要研制适用于土壤微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，所述方 法能够更有效、快速、经济地提取到土壤微生物基因组DNA。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，包括土壤杂质的去除与微生物 细胞的破碎，杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，所述方法具体 包括以下步骤：
[0008] 1) 土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎：称取I-IOg 土壤于50ml离心管中，力口 入10-20ml裂解液，震荡裂解Ι-lOmin，于60-70°C温育l_2h，温育期间每5-10min震荡1-2 次；温育后，10000 -12000rpm/min离心20-30min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入 0. 125-0. 2倍一次上清液体积的Ι-lOmol/L醋酸钾和0. 4-1倍一次上清液体积的质量浓度 40-60%聚乙二醇-800(PEG-800)，于-20°C静置 30-60min，然后 10000-12000rpm/min离 心20-60min，弃废液后加入15-25ml CTAB-NaCl-EDTA溶液溶解沉淀，然后于65-80°C温育 3〇-60min ；
[0009] 2)杂蛋白的抽除：温育后，在上述离心管中加入15-20ml抽提液A抽提， 10000-13000rpm/min离心10-30min，取二次上清液至无菌的离心管中，加入15-20ml抽提 液B抽提，10000-13000rpm/min离心10-30min，取三次上清液至灭菌的离心管中；
[0010] 3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：在上述离心管中加入与三次上清液等体 积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱中，然后10000-13000rpm/min离心l-5min，弃废液，力口 入200-60(^1去蛋白液，然后 10000-13000印111/11^11离心1-511^11，弃废液，加入200-60(^1 漂洗液，然后10000-13000rpm/min离心l-5min，弃废液，加入200-600 μ 1漂洗液，然后 10000-13000rpm/min离心l-5min，弃废液，将DNA吸附柱静置吹干；
[0011] 4)0嫩洗脱：往0嫩吸附柱中加入100-20(^1洗脱液，然后10000-13000印111/1^11 离心l-5min，所得液体为土壤微生物基因组DNA ;后续取2-7 μ I DNA水溶液，于1 %琼脂糖 凝胶中进行电泳检测；
[0012] 其中，所述裂解液由终浓度0· 25-lmol/L氯化钠（Nacl)，终浓度0· Ι-lmol/L乙二 胺四乙酸（EDTA)，质量体积比4-8%十二烷基硫酸钠（SDS)和终浓度0. 3-lmol/L异硫氰酸 胍组成；
[0013] 所述CTAB-NaCl-EDTA溶液由质量体积比1-5%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)，终 浓度l-2mol/L氯化钠（Nacl)和终浓度0· 1-0. 5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA)组成；
[0014] 所述抽提液A是指体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0015] 所述抽提液B是指体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0016] 所述沉淀剂是指质量浓度70-80 %乙醇；
[0017] 所述去蛋白液是由终浓度3-6mol/L盐酸胍和终浓度20-50mmol/L Tris-HCl组 成，pH = 6-7,使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为30-40% ;
[0018] 所述漂洗液由终浓度10-30mmol/L NaCl和终浓度l-5mmol/L Tris-HCl组成，pH =7-8,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为80-90% ;
[0019] 所述洗脱液是指 10_30mmol/L Tris-HCl，pH = 8-9。
[0020] 所述DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
[0021] 本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如所述裂解液由终浓度 0· 25-lmol/L氯化钠（Nacl)，终浓度0· Ι-lmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)，质量体积比4-8% 十二烷基硫酸钠（SDS)和终浓度0. 3-lmol/L异硫氰酸胍组成，是指Nacl在裂解液中的浓 度为0. 25-lmol/L，EDTA在裂解液中的浓度为0. 1-lmol/L，SDS在裂解液中的质量体积比 4-8%，异硫氰酸胍在裂解液中的浓度为0. 3-lmol/L。
[0022] 进一步，所述裂解液由终浓度0· 25mol/L Nacl，终浓度0· lmol/L EDTA，质量体积 比4% SDS和终浓度0. 35mol/L异硫氰酸胍组成。
[0023] 进一步，所述CTAB-NaCl-EDTA溶液由质量体积比2% CTAB,终浓度I. 4mol/L Nacl 和终浓度〇· lmol/L EDTA组成。
[0024] 进一步，所述去蛋白液是由终浓度5mol/L盐酸胍和终浓度20mmol/L Tris-HCl组 成，pH = 6. 6,使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为38%。
[0025] 进一步，所述漂洗液由终浓度20mmol/L NaCl和终浓度2mmol/L Tris-HCl组成， pH = 7. 5,调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为85%。
[0026] 进一步，所述洗脱液是指 10mmol/L Tris-HCl，pH = 8. 5。
[0027] 进一步，所述的步骤3)加入漂洗液，离心，弃废液之后，再次10000-13000rpm/min 离心l-5min，弃废液，将DNA吸附柱静置吹干。
[0028] 本发明采用以上技术方案，利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA，是一种改进的 土壤微生物基因组CTAB提取法，与传统方法相比，该方法提供独有的去蛋白液和漂洗液去 除杂质，能够快速提取到土壤微生物基因组DNA，不仅节省了大量提取时间，同时简化了实 验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到土壤微生物基因组DNA。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明方法提取的土壤微生物基因组DNA的电泳检测图：
[0030] 泳道1为本发明方法提取水稻土壤微生物基因组DNA的试验结果；
[0031] 泳道2为本发明方法提取花生土壤微生物基因组DNA的试验结果；
[0032] 泳道3为本发明方法提取甘蔗土壤微生物基因组DNA的试验结果；
[0033] 泳道 4 为 TAKARA 公司的 DL4500marker。
【具体实施方式】
[0034] 一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，其包括以下步骤：
[0035] 1) 土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎：称取I-IOg 土壤于50ml离心管中，力口 入10-20ml裂解液，震荡裂解Ι-lOmin，于60-70°C温育l_2h，温育期间每5-10min震荡1-2 次；温育后，10000 -12000rpm/min离心20-30min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入 0. 125-0. 2倍一次上清液体积的Ι-lOmol/L醋酸钾和0. 4-1倍一次上清液体积的质量浓度 40-60%聚乙二醇-800(PEG-800)，于-20°C静置 30-60min，然后 10000-12000rpm/min离 心20-60min，弃废液后加入15-25ml CTAB-NaCl-EDTA溶液溶解沉淀，然后于65-80°C温育 3〇-60min ；
[0036] 2)杂蛋白的抽除：温育后，在上述离心管中加入15_20ml抽提液A抽提， 1