获得嗜热链球菌特异性序列的方法及其使用的半随机引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获得嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)特异性序列的方法及其使用的半随机引物。
【背景技术】
[0002] 获得一种细菌的特异性序列，往往需要对网上大量的已知序列进行分析比对；但 有些细菌已测的序列较少，分析起来非常困难，难以得到特异性序列。当然，也可以收集某 一种细菌的所有菌株，进行测序比对，但该方法实验时间较长、费用较高。目前，在网上可 以获取的嗜热链球菌已经经过测序的序列较少，因而难以分析得到嗜热链球菌的特异性序 列。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题就是针对目前通过序列比对获取嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)的特异性序列较难，且无法从未进行全基因组测序的现有 嗜热链球菌菌株直接获取特异性序列的现状，而提供一种无需对未测序的嗜热链球菌菌株 进行测序而可以很方便地获取嗜热链球菌的特异性序列的方法及其所使用的半随机引物。
[0004] 本发明通过下述技术方案解决上述技术问题。
[0005] 本发明提供的技术方案之一是：一种半随机引物，其序列组成如序列表中SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本发明中，所述的半随机引物为一种寡核苷酸，用于PCR反应扩增以捕获模板菌 株的基因组DNA片段。
[0007] 本发明提供的技术方案之二是：一种序列组成如序列表中SEQ ID NO. 1所示的半 随机引物在基因扩增中的应用。
[0008] 所述的基因扩增较佳地为单引物PCR扩增，即扩增体系中只加入一条扩增引物进 行DNA片段的合成。
[0009] 本发明提供的技术方案之三是：一种获得嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)特异性序列的方法，其包括如下步骤：
[0010] ⑴以两株以上的嗜热链球菌菌株的基因组DNA分别为模板，以序列组成如序列 表中SEQ ID NO. 1所示的半随机引物为扩增引物分别进行单引物PCR扩增；
[0011] (2)对步骤（1)扩增获得的共有DNA片段进行测序，并将测序结果进行序列比 对，若比对的结果为该共有DNA片段的序列仅与序列已知的嗜热链球菌的基因同源性大于 99%，则将该共有DNA片段的序列作为嗜热链球菌的特异性序列。
[0012] 在本发明中，步骤（1)中所述的嗜热链球菌可以是已经经过基因组测序的嗜热链 球菌，也可以是未经测序的嗜热链球菌；其中，可以使用未经测序的嗜热链球菌的基因组 DNA为模板是本发明的特别优势之一，因此可以作为优选方案。
[0013] 其中，步骤（1)中所述的单引物PCR扩增为本领域常规所指的含义，即扩增体系中 只加入一条扩增引物进行DNA片段的合成。
[0014] 较佳地，步骤（1)中所述的单引物PCR扩增的反应体系包括如下组分：0.5? 2. 0 μ mol/L 半随机引物，0· 2 ?I. Ommol/L dNTP，I. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02 ?0· IOU/ μ LTaq DNA聚合酶，以及0.5?2. Ong/μ L基因组DNA模板。更佳地，所述的单引物PCR 扩增的反应体系包括如下组分：11^111〇1凡半随机引物，0.51111]1〇1/1^(11'013，1.51111]1〇1凡的1% 2+， 0· 05U/ μ LTaq DNA聚合酶，以及L Ong/ μ L基因组DNA模板。
[0015] 较佳地，步骤（1)中所述的单引物PCR扩增的反应程序包括：①93-96°C，4-6min ; ② 93-96°C，20-40s ;③ 45-58°C，20-40s ;④ 70-72°C，30-120s ;⑤ 70 ?72°C，5 ?IOmin ; 其中，步骤②至④的循环数为25-40。更佳地，步骤（1)中所述的单引物PCR扩增的反应程 序包括：① 95°C，5min ;② 95°C，30s ;③ 50°C，30s ;④ 72°C，2min ;⑤ 72°C，5min ;其中，步骤 ②至④的循环数为35。
[0016] 较佳地，步骤（1)所述的嗜热链球菌菌株的数量为3-10株，更佳地为4-6株。
[0017] 步骤（2)中，所述的共有DNA片段为本领域常规所指，即指步骤（1)的PCR扩增产 物中大小相同的DNA片段，如可以将步骤（1)的PCR扩增产物进行电泳，选择大小相同的电 泳条带作为所述的共有DNA片段，用于后续的测序。
[0018] 步骤（2)中，所述的将测序结果进行序列比对的方法为将测序结果在公共数据库 进行BLAST，更佳地为将测序结果在NCBI网站进行BLAST。
[0019] 步骤（2)中所述的该共有DNA片段的序列仅与序列已知的嗜热链球菌的基因同 源性大于99%为本领域常规所指，即在进行序列比对时，该共有DNA片段的序列仅仅与序 列已知的嗜热链球菌的基因同源性大于99%，而与其他的物种的同源性都不高（至少低于 99% )，甚至非常低；其中，序列已知的嗜热链球菌如本领域技术人员常规的理解，一般指 已经经过基因组测序的嗜热链球菌，如本领域技术人员常规的理解，各类生物信息学公共 数据库，如NCBI建立的Genbank等就收集有大量菌株的基因组信息，其中就包括本发明所 述的序列已知的嗜热链球菌。
[0020] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0021] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0022] 相比于现有技术，本发明的积极进步效果在于：本发明获得嗜热链球菌特异性序 列的方法操作简单、快速、特异性强，而且无需知道目标细菌的核酸序列，也无需依赖大量 的基因数据分析，仅需要通过对有限几株基因序列未知的嗜热链球菌进行PCR反应以及对 所获得的共有DNA片段进行割胶纯化测序，即可获得嗜热链球菌的特异性序列。本发明的 方法通用性强，成本低，实验时间短，具有十分广阔的应用前景。
【附图说明】
[0023] 图1为不同嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的筛选结果。图中编号 "M" 为 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd. 1-4" 分别 为：Streptococcus thermophilusTA40、Streptococcus thermophiIus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364的PCR 结果。
[0024] 图2为不同嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取结果。图中编号"Μ" 为 DL2,000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian)Co, Ltd. D "1-6" 分别为： Streptococcus thermophiIusCICC20379、 Streptococcus thermophiIusCICC6222、 Streptococcus thermophiIusCICC6072、 Streptococcus thermophiIusCICC20378、 Streptococcus thermophilusCICC20364、Streptococcus thermophilusCICC20389 的 PCR 结果。
[0025] 图3为嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取结果。图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分别 为：Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 结果〇
[0026] 图4为嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取结果。图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分别 为：Streptococcus thermophiIusCICC20379λ Streptococcus thermophiIusCICC6222λ Streptococcus thermophiIusCICC6072λ Streptococcus thermophiIusCICC20378λ Streptococcus thermophiIusCICC20364λ Streptococcus thermophiIusCICC20389λ Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophilus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 结果〇
[0027] 图5为不同半随机引物的效果比较。图中"M"为DL2,000DNA(Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd)，编号 "1-3" 为半随机引物 "AP2-AP4" 分别对应的 PCR 结 果，编号4为半随机引物APl对应的PCR结果，编号5为半随机引物AP5对应的PCR结果。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0029] 下述实施例中，如非特别说明，所用试剂和材料均为常规市售可得。
[0030] 下述实施例中，下述实验材料的来源为：
[0031] 嗜热链球菌：
[0032] Streptococcus thermophiles TA40 购自丹尼斯克有限公司；
[0033] Streptococcus thermophilus St-body 3 购自丹尼斯克有限公司；
[0034] Streptococcus thermophiles CICC20174购自上海北诺生物科技有限公司；
[0035] Streptococcus thermophilus CICC20364购自上海北诺生物科技有限公司；
[0036] Streptococcus thermophiles CICC20379购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0037] Streptococcus thermophiles CICC6222购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0038] Streptococcus thermophiles CICC6072购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0039] Streptococcus thermophiles CICC20378购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0040] Streptococcus thermophiles CICC20364购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0041] Streptococcus thermophiles CICC20389购自北京北纳凯创生物技术有限公司D
[0042] 实施例1不同嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的筛选
[0043] (1)模板制备
[0044] 将各菌株活化分离培养，获得的菌落挑选单菌落，接种于Iml MRS培养基，37°C 厌氧培养24小时，离心获得菌体。提取细菌基因组，使用的试剂盒为：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0045] (2) PCR 扩增
[0046] PCR扩增的体系组成为：1 μπιοΙ/L半随机引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0· 5mm