小麦耐盐基因TaBASS2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小麦耐盐基因及其应用，尤其涉及小麦耐盐基因丙酮酸转运体基 因 TaBASS2及其应用，属于生物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严 重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制 约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品 种已成为当前一个十分迫切的任务。
[0003] 利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基 因植物新品种，用于在盐碱地种植是一项具有广阔应用前景的技术。
[0004] 目前，利用基因工程技术开展植物耐盐方面研宄已取得了较大的进展，克隆了大 量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研宄。一些实验表明，将植物本身以 及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的 抗盐能力提尚。
[0005] 在前期研宄中，本实验室利用不对称体细胞杂交方法创制渐渗系技术，将小 麦近缘优质牧草、单子叶植物耐盐性最强的长穗偃麦草染色质渐渗到普通小麦济南 177 (JN177)，创建了一批高产、抗逆、抗病和优质的渐渗系新种质和新品系，从中选育出杂 种渐渗系高产、耐盐新品种山融3号（SR3)(鲁审[2004]030)，获得研宄小麦渐渗系机制和 功能基因的"突变体"新材料。转录组分析显示，盐胁迫下，一个丙酮酸转运体基因在SR3 和JN177中被诱导，而且SR3中的诱导幅度大于JN177,这暗示丙酮酸转运可能与SR3抗逆 性存在一定的关联。然而，经检索关于丙酮酸转运体（BASS)基因 TaBASS2的cDNA核苷酸 序列以及该基因在培育抗盐植物中的应用还未见报道。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种小麦耐盐基因一一丙酮酸 转运体基因 TaBASS2及其应用。
[0007] 本发明所述的小麦耐盐基因一一丙酮酸转运体基因为丙二烯氧化物还原酶基因 TaBASS2,其特征在于：该基因 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本发明还提供了含上述小麦耐盐基因一一丙二烯氧化物还原酶基因 TaBASS2的植 物表达载体pSTART或pGA3626。
[0009] 本发明还公开了上述小麦耐盐基因丙二烯氧化物还原酶基因 TaBASS2以及所述 植物表达载体pSTART或pGA3626在培育耐盐植物中的应用。
[0010] 其中：所述植物优选是普通小麦或拟南芥。
[0011] 将本发明所述小麦耐盐基因导入植物细胞，植物即可获得耐盐能力，若在盐渍化 土壤中种植，可实现植物耐盐及重复利用次质土壤目的。为了便于对转基因植物或细胞系 进行筛选，可以对含有所述基因 TaBASS2的植物表达载体（pSTART或pGA3626)进行加工， 如可以加入选择标记（Bialaphos等）或者具有抗性的抗生素标记物（卡那霉素）等，事实 上任何一种可以将外源基因导入植物中的表达载体都可以应用本发明。基于此，本发明提 供的基因可广泛用于培育耐盐农作物品种。
[0012] 本发明的有益效果是：利用植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦丙酮 酸转运体基因即丙二烯氧化物还原酶基因 TaBASS2,并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基 因转入小麦和拟南芥，经过实验比较分析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高，为该基因 广泛用于培育耐盐农作物新品种提供了基础。
【附图说明】
[0013] 图lTaBASS2基因全长cDNA序列的扩增结果，显示山融3号中TaBASS2基因开放 阅读框的扩增获得1245bp的片段。
[0014] 其中：M 为 λ DNAAEcoR I +Hind III) Marker (下同）。
[0015] 图2山融3号胁迫根系中TaBASS2的QRT-PCR分析。
[0016] 图3TaBASS2转基因小麦植株QRT-PCR鉴定和幼苗期在NaCl处理后的生长情况。
[0017] 其中：VC :载体对照；OX :过表达转基因植株。
[0018] 图4TaBASS2转基因拟南芥在NaCl处理后的生长情况。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1、山融3号小麦耐盐基因丙二烯氧化物还原酶基因 TaBASS2的克隆
[0020] I. 1植物材料的处理
[0021] 1)将小麦种子（山融3号）在4°C春化20天
[0022] 2)用70 %酒精处理种子2-3分钟。
[0023] 3)弃去酒精，用无菌水洗3-5次，每次充分振荡混匀。
[0024] 4)用无菌水浸泡种子，避光，25°C，40-60rpm/min，摇床孵育过夜。
[0025] 5)将种子正面向上，摆放在用无菌水充分润湿的滤纸上，避光萌发。
[0026] 6)3天后将种子转移到培养篮中，l/2Hoagland，水培，置于23°C，长日照的培养间 生长至两叶一心期。
[0027] 1. 2小麦RNA提取
[0028] 1)将超低温冻结的30-50mg RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵 中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没 有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。
[0029] 2)将粉末状RNA提取样品小心而快速的转移到液氮预冷的2ml离心管中，加入适 量的I. 5ml RNAiso Reagent，震荡混匀，此时裂解液呈透明状，室温静置5分钟。
[0030] 3) 12, OOOg 4°C离心 5 分钟。
[0031] 4)小心吸取上清液，移入新的2ml离心管中（切勿吸取沉淀）。
[0032] 5)加入氯仿（RNAiso Reagent的1/5体积量），盖紧离心管盖，用力震荡（氯仿沸 点低、易挥发，振荡时应防止离心管盖突然弹开）。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象） 后，再室温静置5分钟。
[0033] 6) 12, OOOg 4°C离心 15 分钟。
[0034] 7)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，S卩：无色的上清液、中间的 白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中（切忌 吸出白色中间层）。
[0035] 8)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15?30°C下 静置10分钟。
[0036] 9) 12, OOOg 4°C离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现白色沉淀。
[0037] 10)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇I ml (切勿触及沉淀），轻 轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12, OOOg 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制 RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。
[0038] 11)室温干燥沉淀2?5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解， 有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的RNase-free水溶解 沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后用于后续试验或于-80°C保 存。
[0039] 12) RNA质量检测：a)通过测定0D26(i、0D28(i、0D23(i的吸收值计算RNA的含量及纯度； b) 1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解；c) RNA直接进行PCR检测是否存在DNA污染。
[0040] I. 3cDNA第一链的快速扩增
[0041] DMicrotube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6 μ 1。
[0042] 模板 RNA (total RNA) 5 μ g
[0043] Oligo (dT) 18primer (50 μ Μ) 1 μ 1
[0044] RNase free dd H2O Up to 13. 5 μ I
[0045] 2) 70°C保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
[0046] 3)离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。
[0047] 4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
[0048] 上述模板RNA/引物变性溶液 13. 5μ1 5XM-MLV buffer 4μ I dNTP Mixture (各 10μ Μ) 1μ 1 RNase inhibitor (4〇υ/μ 1) 0. 5μ 1 Rtase M-MLV (RNase H-) (20〇υ/μ 1) 1μ 1
[0049] 5)42°0保温1小时。
[0050] 6) 70°C保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA 的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用1 μ 1?5 μ 1。
[0051] L 4TaBASS2 全长克隆
[0052] 1)引物序列：
[0053] TaBASS2-l ：ATGGCGCCTTCCGCGACCTGCC
[0054] TaBASS2-2 ： TCATTCCTTGAAATCGTCCTTG
[0055] 2) PCR 反应体系（20 μ L):
[0056] IOXbuffer 2μ I 模板（第一链cDNA产物） 1μ 1 dNTPs (2. OmM each) 0, 5μ 1 Primerl (5μ Μ) 1μ 1 Primer2 (5μ Μ) 1 μ 1 高保真Taq酶（STRATAGEN，Cat No: 600380) 0. 5μ I dcffi20 14μ I
[0057] 3)?0?反应程序为：94°〇预变性51^11;94°〇变性3〇86(3,55°〇复性3〇86(3,72°〇延伸 l