以2-Cys Prx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物寄生线虫杀虫剂领域，具体涉及以2-Cys型过氧化物还原酶 (Peroxiredoxins，Prx)即2-Cys Prx为祀点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 植物寄生线虫是引起植物病害的重要病原物之一。在全球范围内，植物病原线虫 的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的演化而日益严重，已成为农业生物灾害 中继昆虫、植物病害之后的第三大灾害。据报道，严重危害我国农、林、经济作物等的线虫达 100多种。植物寄生线虫每年对全世界农作物的产量损失大约为1250亿美元。目前防治线 虫的方法主要是通过栽培技术、作物轮作、抗性品种的选择，结合使用一些现在仍批准使用 的化学杀线虫剂。
[0003] 杀线虫剂是伴随着线虫危害的日益严重而诞生的，虽然这些化学药剂对线虫防治 起到了积极作用，但我国现有防治线虫病害的药剂品种少，可供选择性不强，有关杀线虫剂 的研宄和开发，无论是理论研宄和技术开发上，都还是农药领域中非常薄弱的部分，杀线虫 的活性成分和作用机制方面研宄较少。因为环境压力，植物寄生线虫的化学防治方法的发 展受到严峻的挑战。开发新型、低毒、高效杀线虫剂势在必行。植物线虫抗氧化系统机制的 深入研宄为药物靶点的开发和利用提供了理论依据和新的切入点。
[0004] 生物在有氧代谢过程中普遍产生活性氧（reactiveoxygen species, ROS)，为了 抵抗ROS的损伤，生物在长期的进化过程中，形成了谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxudase, GPx)、过氧化氢酶（catalase, CAT)、超氧化物歧化酶（superoxide 虹811111丨386,300)、过氧化物还原酶&61'〇1；[代(101；[118，？^8)等各种抗氧化系统。为及时清 除过多的内源性活性氧族及其周围环境包括寄主产生的外源性ROS的损害，植物线虫体内 同样也存在各种抗氧化系统，使之维持在一个正常的水平。例如，在植物病原物侵染寄主过 程中，植物通过产生过氧化物来抵御病原物的入侵，线虫等病原物则通过分泌抗氧化酶来 清除其毒害。
[0005] 作为抗氧化酶家族中的一员，过氧化物还原酶基因广泛存在于原核生物和真核生 物中。目前已发现的Prx功能除了保持ROS平衡，使机体免受DNA损伤，蛋白变性及脂类过 氧化等伤害外，还参与细胞凋亡、增殖、分化、细胞内信号传递以及基因表达调控等多种生 物功能。随着对Prxs研宄的不断深入，将Prxs作为潜在的药物、疫苗或诊断祀标正受到越 来越多的关注和研宄。
[0006] 近年来对Prxs应用的研宄主要集中在药物、疫苗或诊断目标三个方面，其中以 Prx作为抗原进行疫苗研制及Prx与肿瘤的关系方面研宄较多。在以Prx作为抗原的研宄 中，国外更是已有相关专利的报道，如，马来丝虫（Brugia malayi)Prx6作为疫苗抗原已经 申请美国专利（U. S. Patent 6, 352, 836);杜氏利什曼原虫（L. donovani)Prxla作为一种疫 苗抗原候选物已经申请了美国专利（U. S. Patent 7795406)，而以Prx为靶标进行防治植物 线虫药物研制的报道目前还比较少。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种用于以2-Cys型过氧化 物还原酶为靶点进行抗植物线虫侵染化合物筛选的重组表达质粒，该重组表达质粒为 pET41b_DdPrx。
[0008] 本发明同时提供一种以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点的抗植物线虫侵染化合 物的筛选方法，该方法包括如下步骤：
[0009] a、构建含马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx基因的重组表达质粒pET41b-DdPrx ;
[0010] b、将重组表达质粒转入BL21 (DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导培养以稳定表达重 组Dd-PRX蛋白；所述重组Dd-PRX蛋白为马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx与pET-41b融合蛋 白。所述IPTG诱导培养条件为：温度18-37°C，IPTG浓度为0. 2-1. 4mmol/L。
[0011] c、将候选化合物与重组DdPrx蛋白共孵育，根据硫氰酸铁法检测候选化合物是否 对重组DdPrx蛋白具有较高离体抑制活性。
[0012] 所述共孵育是指将重组DdPrx蛋白加入含10ymol/L-40ymol/L候选化合物的 反应缓冲液中，在30°C水浴条件下孵育30min，其中，该反应缓冲液为含lOmmol/L DTT的 IXPBS缓冲液，pH为7.0。
[0013] 依本发明提供的筛选方法获得的对重组DdPrx蛋白具有较高的抑制活性的化合 物为1，4-二氧代-2, 3-二溴甲基喹啉，经验证，该化合物具有抗植物线虫侵染的活性，能抵 抗植物线虫的侵染，能用于制备抗植物线虫侵染药物。
[0014] 本发明还提供上述筛选方法在研发抗植物线虫侵染药物中的应用。
[0015] 本发明的离体筛选方法是基于硫氰酸铁法设计，其原理在于Prx蛋白能够催化 H2O2转化为H 20和O2，剩余的H2O2则将Fe 2+氧化为Fe 3+，Fe3+再与硫氰酸根离子形成的红色 络合物在A475处有最大吸光值从而测定微量H 2O2的变化量。而2-Cys Prx抑制剂能明显降 低重组DdPrx蛋白催化H2O2活性。用于2-Cys Prx抑制剂的筛选，具有直接、简便、快速等 优点，既可用于手工筛选，又可用于大规模高通量抑制剂的筛选。且本发明验证用的活体筛 选方法是基于水稻根结线虫具有侵染水稻根这一特性设计，候选化合物若具有抗线虫侵染 的活性，则水稻根结线虫侵染水稻根产生的根结与对照相比将明显减少。此方法不需染色 即可用肉眼观察，便于实时跟踪候选化合物抗线虫侵染的活性变化。
【附图说明】
[0016] 图1为DdPrx阅读框克隆及酶切鉴定电泳结果图。
[0017] 图中，Ml :5000 marker，I :PCR 产物，2 :pET-41b 经 XhoI 单酶切，3 :pET41b-DdPrx 经 XhoI 单酶切，4 :pET41b_DdPrx 经 NcoI 单酶切，5 :pET41b_DdPrx 经 XhoI 和 NcoI 双酶切， M2 :15000 marker〇
[0018] 图2为诱导IPTG浓度及温度对重组DdPrx蛋白表达量的影响。
[0019] 图中：M:即用型蛋白质分子量标准（低）；
[0020] A为不同IPTG浓度的重组DdPrx蛋白表达量。其中，I :IPTG浓度为1.4mmol/L， 2 :IPTG 浓度为 I. 0mmol/L，3 :IPTG 浓度为 0· 6mmol/L，4 :IPTG 浓度为 0· 2mmol/L，5 :IPTG 浓 度为 Ommol/L ;
[0021] B为18°C时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，I :有IPTG诱 导的超声破菌的上清，2 :有IPTG诱导的超声破菌的全菌液，3 :无 IPTG诱导的全菌液；
[0022] C为25°C时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，1 :有IPTG诱 导的超声破菌的上清，2 :有IPTG诱导的超声破菌的全菌液，3 :无 IPTG诱导的全菌液；
[0023] D为37°C时BL21(DE3)感受态细胞表达重组DdPrx蛋白结果。其中，I ^IPTGS 导的全菌液，2 :有IPTG诱导的全菌液，3 :有IPTG诱导的超声破菌的上清。
[0024] 图3为育有水稻幼苗的小烧杯放入装有适量湿润细沙的透明塑料箱中培养图。
[0025] 图4为不同浓度的1，4-二氧代-2, 3-二溴甲基喹啉与药剂对照、丙酮对照根结生 长趋势图。
[0026] 图中，药剂A为1，4-二氧代-2, 3-二溴甲基喹啉，对照药剂B为2, 3-双（溴甲 基）喹啉。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx基因的克隆
[0028] 根据GeneBank中马铃薯腐烂茎线虫cDNA全长序列进行特异性引物设计，上游引 物 N-PRXF :5' -CCATGGTACCCAAGTTTGAGACCATC-3' (SEQ ID No. 1)，下划线为 NcoI 酶切位点； 下游引物 X-PRXR :3' -ATAAAGCCGTTCGTCTTCGAGCTC-5' (SEQ ID No. 2)，下划线为 XhoI 酶切 位点。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0029] 以通过反转录方法制备的马铃薯腐烂茎线虫cDNA为模板，用上述引物进行PCR 扩增，反应体系为 5XGXL PCR Buffer 10 μ l、dNTP Mixture 4 μ 1、N-PRXF 1 μ 1、X-PRXR lyl、Prime STAR GXL 0.5yl、cDNA 1以1、及4〇 32·5μ1。反应条件为：94°C5min; 94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin，35个循环；72°C lOmin。实施例2重组表达质粒的构建
[0030] 将实施例1中得到的PCR产物连入pEASY-Blunt克隆载体并转入Transl-Tl，取 200 μ 1菌液在含50ug/ml卡那霉素的LB平板上，37°C过夜培养。次日挑单菌落进行菌液 培养，经菌液PCR验证的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果用 DNAMAN(7. 0.2. 176)与已知马铃薯腐烂茎线虫Prx cDNA进行序列比对，结果一致。
[0031] 将Prx-pEASY-Blunt重组克隆质粒和pET-41b表达质粒分别经NcoI和XhoI (NEB) 双酶切，胶回收PRX基因及pET-41b表达质粒，按T4连接酶（北京全式金）步骤在4°C下 过夜连接。把2 μ 1连接反应产物加入到100 μ 1解冻后的BL21 (DE3)感受态细胞（全式金 生物技术有限公司产品）中，冰浴30min ;42°C水浴60-90S ;立即冰浴2-3min ;每管加入