一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方 法。
【背景技术】
[0002] 杨树分布广，适应性强，是具有重要经济价值的优良阔叶树种。杨树生长快，容易 繁殖，易于基因工程操作，被认为是林木基因工程中的理想模式树种。根癌农杆菌介导法 是目前杨树遗传转化中应用最广泛且结果较为理想、技术较为成熟的一种外源基因转化方 法。根癌农杆菌介导法具有以下优点：操作简便；外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝；转 移DNA片段明确，可转移大片段DNA ;可直接用不同的植物组织进行基因转移等。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化的转化 效率。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法。
[0005] 本发明所提供的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括Ml)和M2):
[0006] Ml)用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体；
[0007] M2)培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株；
[0008] 所述外植体的制备方法如下：将杨树组培苗的叶片从垂直主脉方向一分为二，得 到近叶柄端半叶片和远叶柄端半叶片；将所述近叶柄端半叶片的叶边缘去除得到所述外植 体。
[0009] 上述方法中，所述近叶柄端半叶片可为所述叶片的主叶脉清晰部分。
[0010] 上述方法中，所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染 的外植体可包括Hl)和H2):
[0011] Hl)用MS侵染液重悬所述重组根癌农杆菌的菌体得到农杆菌侵染液；
[0012] H2)用所述农杆菌侵染液转染杨树的外植体得到所述转染的外植体。
[0013] 上述方法中，所述MS侵染液可为向MS液体培养基中加入MES、葡萄糖和AS得到的 液体，其中所述MES、所述葡萄糖和所述AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、200 μ M。
[0014] 上述方法中，所述转染的时间可为10-30分钟。所述10-30分钟具体可为15分钟。
[0015] 上述方法中，所述杨树组培苗按照如下方法获得：将无菌杨树顶芽接入生根培养 基在光照下培养15-30天得到所述杨树组培苗。
[0016] 其中，所述生根培养基为向MS培养基中加入NAA得到的固体培养基，其中NAA的 浓度为〇· lmg/L。
[0017] 上述方法中，所述杨树组培苗也可按照如下方法获得：将无菌杨树叶片接入分化 培养基在光照下进行培养得到无根组培苗；将所述无根组培苗接入所述生根培养基在光照 下培养15-30天得到所述杨树组培苗。
[0018] 其中，所述分化培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA和TDZ得到的固体培养基， 其中所述NAA、所述6-BA和所述TDZ的浓度分别为0· lmg/L、0. 2mg/L、0. 01mg/L。
[0019] 上述方法中，所述15-30天具体可为18-22天。所述18-22天具体可为20天。
[0020] 上述方法中，所述培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植 株包括Al)-A5):
[0021] Al)共培养所述转染的外植体，得到共培养的外植体；
[0022] A2)将所述共培养的外植体进行恢复培养，得到恢复培养的外植体；
[0023] A3)将所述恢复培养的外植体进行分化培养得到抗性丛生芽；
[0024] A4)将所述抗性丛生芽进行增殖培养得到抗性幼芽；
[0025] A5)将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
[0026] 上述方法中，所述共培养所述转染的外植体为将所述转染的外植体在共培养基上 于24-25°C下黑暗中培养3天。所述共培养基为向MS培养基中加入MES、葡萄糖、NAA、6-BA 和AS得到的固体培养基，其中，所述MES、所述葡萄糖、所述NAA、所述6-BA和所述AS的浓 度分别为 500mg/L、10g/L、0. Img/L、0. 2mg/L、200 μΜ。
[0027] 所述恢复培养为将所述共培养的外植体在恢复培养基上于25°C、16h光照/8h黑 暗下培养。所述恢复培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ和特美汀得到的固体培 养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0. Img/L、0. 2mg/L、 0. 01mg/L、250mg/L。
[0028] A3)所述分化培养为将所述恢复培养的外植体于25°C、16h光照/8h黑暗、光照强 度2000-30001UX下培养。A3)所述分化培养的时间可为四周。A3)所述分化培养的培养基 可为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ、抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、 所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0. Img/L、0. 2mg/L、0. 01mg/L、250mg/L。
[0029] 所述增殖培养为将所述抗性丛生芽在增殖培养基上于25°C、16h光照/8h黑暗下 培养。所述增殖培养基为向MS培养基中加入抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述 特美汀的浓度为250mg/L。
[0030] 上述方法中，所述恢复培养的时间可为5-10天。所述5-10天具体可为7天（一 周）。
[0031] 上述方法中，所述将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转 基因植株包括B1)、B2)和B3):
[0032] BI)将所述抗性幼芽进行生根培养得到抗性植株；
[0033] B2)将所述抗性植株的顶芽进行二次生根培养得到根成放射状生长的杨树转基因 植株；
[0034] B3)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得到所述外源基 因稳定表达的杨树转基因植株。
[0035] 其中，BI)所述生根培养和B2)所述二次生根培养的培养基均可为向MS培养基 中加入NAA、抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA和所述特美汀的浓度分别为 0· lmg/L、250mg/L〇
[0036] BI)所述生根培养为将所述抗性幼芽在25 °C、16h光照/8h黑暗、光照强度 2000-30001ux下培养15-20天；B2)所述二次生根培养为将所述抗性植株的顶芽在25°C、 16h光照/8h黑暗、光照强度2000-30001ux下培养15-20天。
[0037] 上述方法中，所述将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得 到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株，包括Dl)和D2):
[0038] Dl)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片进行二次分化培养得到二次 分化无根组培苗；
[0039] D2)将所述二次分化无根组培苗进行生根培养得到所述外源基因稳定表达的杨树 转基因植株。
[0040] 其中，D2)所述生根培养的培养基可为向MS培养基中加入NAA、抗生素和特美汀得 到的固体培养基，其中所述NAA和所述特美汀的浓度分别为0. lmg/L、250mg/L。
[0041] D2)所述生根培养可为将所述二次分化无根组培苗在25°C、16h光照/8h黑暗、光 照强度2000-30001ux下培养15-20天。
[0042] 所述二次分化培养的培养基可为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ、抗生素和特 美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为 0· lmg/L、0. 2mg/L、0. 01mg/L、250mg/L。
[0043] 所述二次分化培养为将所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片在25°C、 16h光照/8h黑暗、光照强度2000-30001ux下培养四周。
[0044] 上述方法中，所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片可为所述根成放射状 生长的杨树转基因植株的叶片的主脉清晰部分。
[0045] 上述方法中，所述方法还包括将所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株进行炼 苗和移栽的步骤。
[0046] 上述方法中，所述炼苗包括HI)、H2)、H3)和H4):
[0047] Hl)将盛有所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株的容器松口，保持一天；
[0048] H2)在无阳光直射处将所述容器的盖打开，保持一天；
[0049] H3)在阳光下培养所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株一天，得到炼苗后的 杨树转基因植株；
[0050] H4)将所述炼苗后的杨树转基因植株的根部洗净后放在锥形瓶中室温下水培5-7 天，1-2天换一次水，直至长出新根长约lcm。
[0051] 所述移栽包括将所述炼苗后长出新根的杨树转基因植株移栽至土中（灭菌营养 土和輕石比例为1 :1)的步骤。
[0052] 上述方法中，所述杨树具体可为山新杨（Populus davidianaXP. bolleana)。所述 杨树也可为欧美杨107(P. euramericana)