一种植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种选择出来的植物乳杆菌代谢产物对变异链球菌生物膜抑制性的 分析方法，该乳杆菌的代谢物及其成分可以通过抑制活性来减少口腔中变异链球菌的数 量，用于预防或治疗龋齿，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 龋病是人类常见的细菌感染性疾病，能引起牙体硬组织进行性的破坏，造成龋齿 (又称"虫牙"或"蛀牙")，严重危害口腔健康。第60届世界卫生大会决议指出，必须将预防 口腔疾病和促进口腔卫生纳入慢性病综合预防和治疗规划。随着口腔微生物物学、免疫学 及生物化学研宄的发展，目前比较公认的致龋观点是四联因素论，其基本观点包括：龋病是 含糖类食物（尤其是蔗糖）进入人体口腔后在牙菌斑内由于变异链球菌等致龋菌的作用， 利用底物，发酵产酸，经过一定的时间，将牙齿的无机物溶解破坏所致。在龋齿发病过程中 应具有四个必需的因素：（1)致龋菌；（2)食物（糖类或碳水化合物）；（3)宿主易感牙齿； (4)牙菌斑，并且内在的pH在临界pH5以下维持一定的时间。
[0003] 目前的大量研宄证实，血链球菌和变异链球菌是在龋病病损部位中最常分离出的 菌种，而变异链球菌因为具有一些重要的毒力因子，被公认为重要的致龋菌。其毒力因子涉 及黏附、产酸、耐酸和合成胞外多糖等方面的因素，是细菌致龋的物质基础。变异链球菌可 以介导细菌对牙齿表面的非蔗糖依赖性黏附，在细菌对牙齿表面的初始黏附及促进菌体之 间的聚集中起重要作用。此外，它还能利用蔗糖和葡糖基转移酶（GTFs)合成具有很强粘性 的水不溶性胞外多糖（Loesche WJ，等人，Microbiol Rev. 50:353-380,1986)。
[0004] 从龋病的细菌性致龋的病因出发，目前预防和治疗龋齿多从减少变异链球菌发挥 作用的角度出发。如减少变异链球菌的数量，目前常用的药剂是洗必泰漱口水等；减少糖 的摄入，尤其是蔗糖等，目前常用变异链球菌难代谢的甜味剂，如山梨醇、木糖醇、阿斯巴甜 等；去除牙菌斑，目前常用的是机械去除。
[0005] 传统观点认为乳杆菌是龋病的主要致龋菌，但现在研宄发现，乳杆菌在龋病发病 过程中的始动作用不明显，不是首先诱发龋的病原菌，但在龋已形成，促龋发展中起作用， 尤其在牙本质深龋的发展中起重要作用。一旦龋病损害形成，病损局部和唾液中的乳杆菌 计数便迅速增加，所以常通过测定唾液中乳杆菌数量来预测龋病的发展趋势，可作为流行 病病学调查的"龋标志菌"。这些乳杆菌一般分离自牙菌斑内，具有一定的致龋性。
[0006] 牙菌斑生物膜是龋病发生的始动因子，在龋病的发生中发挥着重要作用。目前还 没有乳酸菌的代谢产物对变异链球菌生物膜的抑制性的专利文件。因此，筛选一株对浮游 的变异链球菌具有抑制作用的乳酸菌，并且证明其代谢产物中的有效成分在生物膜模型中 具有良好的抑制作用，同时研制其代谢产物的有效成分的实际用途就显得十分必要。
【发明内容】
[0007] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本 部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0008] 鉴于上述和/或现有植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法及植物乳杆菌FB-T9 代谢产物在治疗和预防龋齿方面的应用中存在的问题，提出了本发明。
[0009] 因此，本发明的一个目的是提供一种植物乳杆菌FB-T9代谢产物对变异链球菌生 物膜抑制性的建模以建立生物膜基础上的分析方法。
[0010] 为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种 植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法，其包括，植物乳杆菌FB-T9代谢产物对变异链球 菌生物膜形成的影响分析，其包括：(a)对变异链球菌生物膜形成量的影响：制备变异链球 菌菌悬液；在Oh时，往培养介质中加入变异链球菌菌悬液，在培养中的第0h，第6h，第12h 这三个时间点，分别加入植物乳杆菌FB-T9发酵上清液，一起培养到24h ;或者把变异链球 菌单独培养24h或48h，去除培养基及浮游的细菌，再加入植物乳杆菌FB-T9发酵上清液； 阴性对照组和阳性对照组分别加入等量的生理盐水和醋酸氯己定溶液；培养结束后，弃游 离细菌，去离子水洗涤，自然干燥；加入结晶紫溶液，室温下染色，使结合的细菌着色；倾去 染色液后，去离子水洗涤，干燥后加入混合的乙醇/丙酮混合液显色，酶标仪600nm测定吸 光度；(b)对变异链球菌生物膜结构和活性的影响：生物膜标本制备：在培养皿中加入变异 链球菌菌悬液和含有0. 25%蔗糖的TSB培养基，在培养时间为第0h、6h、12h时分别加入植 物乳杆菌FB-T9发酵上清液，每个时间点培养3个样品，厌氧培养24h，PBS冲洗，去除表面 浮游细菌，立即于室温下暗箱中染色；或者先培养变异链球菌，形成24h或48h生物膜后，去 除培养基，PBS洗涤，去除表面浮游细菌，加入植物乳杆菌FB-T9发酵上清液，厌氧培养24h， 去除浮游菌，荧光染色；荧光染料的配制及染色：用荧光染料CFSE、PI分别对活菌、死菌进 行染色，使得活细菌、死细菌分别发出绿色荧光，红色荧光，从而可以观察到生物膜结构，染 色结束后用PBS洗涤，除去残留染料；激光共聚焦显微镜观察：将上述已完成荧光染色的生 物膜标本放置在CLSM下观察，物镜X20,目镜X 10,观察生物膜结构的激发光为510/480。 以样本最强信号点为焦平面，以该平面为参照点，沿Z轴进行2um为步距进行断层扫描，最 后进行三维重建，得到生物膜立体结构，处理记录生物膜厚度、细菌总面积、活菌面积、死菌 面积及计算活菌百分比；植物乳杆菌FB-T9代谢产物对变异链球菌生物膜中胞外多糖的影 响分析：采用如步骤（b)中的方法制备生物膜标本，用荧光染料使胞外多糖发出蓝色荧光， 用CLSM观测时使用的激发光为400?490nm ;对生物膜状态下变异链球菌合成不溶性胞外 多糖的影响分析，其包括：在聚苯乙烯细胞培养皿中，加入异链球菌菌悬液和含有〇. 25% 蔗糖的TSB培养基，厌氧培养；在变异链球菌24h生物膜形成中的第0h、6h、12h时加入植 物乳杆菌FB-T9发酵上清液，24h后去除培养基，PBS洗涤，去除表面浮游的细菌；或者加入 变异链球菌菌悬液和含有〇. 25%蔗糖的TSB培养基，厌氧培养，形成24h或者48h生物膜， 去除培养基，PBS洗涤，去除表面浮游的细菌，加入植物乳杆菌FB-T9发酵上清液，厌氧培养 24h，去除孔内的液体，PBS洗涤，去除表面浮游的细菌；加入NaOH，收集菌体，收集上清液， 沉淀再用NaOH洗涤，合并上清液，作为水不溶性胞外多糖的样品；用蒽酮-硫酸法测胞外多 糖的含量。
[0011] 作为本发明所述的植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法的一种优选方案，其 中：在对所述植物乳杆菌FB-T9代谢产物对变异链球菌生物膜形成的影响分析之前，还包 括：用不同温度处理植物乳杆菌FB-T9的发酵上清液，再通过抑菌实验观察其抑菌性的变 化情况，得到有效抑菌物质具有热稳定性，排除大分子蛋白质作为抑菌物质的可能；把植物 乳杆菌FB-T9的发酵上清液的pH调到不同的值，再通过抑菌实验观察其抑菌性的变化情 况，得到有效抑菌物质具有pH依赖性，即pH越低，抑菌效果越好；用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶 和蛋白酶K处理植物乳杆菌FB-T9的发酵上清液，再通过抑菌实验观察其抑菌性的变化情 况，得到抑菌效果显著下降，证明其有效抑菌物质中主要含有小分子多肽类细菌素；用过氧 化氢酶处理植物乳杆菌FB-T9的发酵上清液，再通过抑菌实验观察其抑菌性的变化情况， 得到抑菌效果下降，说明其有效抑菌物质中含有过氧化氢。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种植物乳杆菌FB-T9的代谢产物在治疗和预防龋 齿方面的应用。其为维护口腔健康，预防龋齿提供新的途径和解决方案。
[0013] 本发明的有益效果：本发明的植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法从生物膜的 角度分析了植物乳杆菌FB-T9代谢产物对致龋病因变异链球菌的抑制作用；而植物乳杆菌 FB-T9的代谢产物在治疗和预防龋齿方面的应用，进一步挖掘了益生菌的功能，为维护口腔 健康，预防龋齿提供新的途径和解决方案。
【附图说明】
[0014] 图1是植物乳杆菌FB-T9代谢产物对变异链球菌生物膜形成量的抑制作用；
[0015] 图2是植物乳杆菌FB-T9代谢产物对变异链球菌生物膜中细菌总面积的影响；
[0016] 图3是植物乳杆菌FB-T9代谢产物对变异链球菌生物膜中胞外多糖总面积的影 响；
[0017]