一种西瓜枯萎病菌的检测引物、检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农作物病害检测鉴定及植物检疫的领域，具体是一种西瓜枯萎病菌的 检测引物、检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 西瓜枯萎病俗称蔓割病或萎蔫病，是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum)引起的一种世界性瓜类土传病害。它的发生极为普遍，对西瓜产 量和品质构成了严重的威胁，是西瓜生产上的重要病害。目前，对这类维管束病害的有效防 治方法主要是依靠抗病品种选育，但可供选育的抗病品种抗源单一，效率不高。有研宄人员 从西瓜根际土壤中筛选出对西瓜枯萎病菌防治效果好、无污染土壤中生存良好的放线菌菌 株XF9、XF18和XF22,能较好的防治西瓜枯萎病。三种有益微生物为生物农药的研发奠定 了基础，也为西瓜枯萎病上拮抗菌的拮抗机制奠定了理论基础。国际上公认的西瓜枯萎病 菌有3个生理小种，即生理小种0号、1号和2号，其中2号生理小种的侵染性最强。除以上 3个生理小种外，还有其他的小种分化，生理小种3于2010年鉴定分离，但在中国尚未见报 道，需进一步证实。传统上对西瓜枯萎病菌的鉴定主要是采用形态特征的比较法，即对不同 地区的西瓜枯萎病菌分离物进行形态特征（如菌落颜色、菌落密度、大小孢子的大小与形 状以及菌落直径等）的比较。但利用传统的鉴定方法来鉴别病原菌准确性不高，已不能满 足生产的要求。近年来，随着分子生物学技术的发展，包括AFLP、RFLP、RAPD以及SCAR在内 的分子检测技术在病原菌鉴定、分类及群体遗传多样性研宄中得到植物病理学家的高度重 视。基于特异基因组设计的特异性引物已经广泛应用于病原菌的分子检测，前人基于特异 性引物成功建立了快速检测双重PCR技术已用于检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌、 小麦条纹花叶病毒和小麦花叶病毒等植物病原菌的分子鉴定体系。目前在尖孢镰刀菌的分 子检测方面，有研宄人员利用甘蓝枯萎病菌特异性引物Focs-l/Focs-2和尖孢镰刀菌通用 引物W106R/W106F建立了检测甘蓝枯萎病菌的多重PCR检测体系。该技术既可应用于甘蓝 枯萎病发病区病情的检测，也可从发病植株中检测出甘蓝枯萎病菌。而对于西瓜枯萎病菌 的分子检测，有研宄人员把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的2对特异性引物Fn-l/Fn-2和 Mn-l/Mn-2置于同一反应中，建立了检测西瓜枯萎病菌和蔓枯病菌的双重PCR体系，但这种 双重PCR体系适用于检测两种病原菌，双重PCR只检测西瓜枯萎病菌的方法在国内外都未 见报道。
【发明内容】
[0003] 为解决现有技术中通过形态特征检测西瓜枯萎病菌不精确、操作不简便的缺陷， 本发明公开了一种西瓜枯萎病菌检测试剂盒及其检测方法，其实现的目的是，从生物分子 层面上、以高精确度检测出西瓜枯萎病菌，并且采用该试剂盒以及检测方法操作简便、特异 性强且灵敏度高，对于西瓜枯萎病菌引起病害显症之前的早期检测和诊断具有十分重要的 意义。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，本发明公开了检测西瓜枯萎病 菌的检测引物，由枯萎病菌通用引物和只能特异的扩增西瓜枯萎病菌的引物组成的双重 检测引物集，其中，枯萎病菌通用引物对，？〇8-1? :5'-60461^6了4061^41^64(：(：-3'，下游引 物序列为Fos-S : 5 ' -CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3 ' ；特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物对， 其上游引物序列为Fow-R :5' -CCCGCTGGCTACTAATCTTTGA-3'，下游引物序列为：Fow-S : 5' -ATGTAGTGGCGATACTTCCTTG-3' ；本检测试剂盒中的检测双重检测引物集，其中Fos为公 开发表的用于检测枯萎病菌的引物对，而特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物对则为本实验室 通过对西瓜枯萎病菌进行全基因组测序，并通过比较基因组学的方法找出西瓜枯萎病菌特 异于其他枯萎病菌的基因组片段，然后针对西瓜枯萎病菌的特异片段序列设计出了一系列 引物对，并对这些引物对进行筛选，筛选出那些扩增的特异性强，并且不会和Fos引物相互 干扰的引物对。最后得到的Fow引物能够特异扩增出一条491bp的条带，该引物对灵敏度 高、特异性强，能够用于带西瓜枯萎病菌的快速、精确的分子检测。
[0005] 本发明还公开了包含上述检测引物的检测试剂盒，包括均为Iyl的枯萎病菌通 用引物和特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物，且两种引物中上游引物与下游引物的体积比为 I : l、2XTaq Master Mix(Dye ?1118)12.5以1、1以1的西瓜枯萎病菌阳性对照0嫩、重量浓 度多99%的超纯水9.5μ1。检测引物与其它辅助试剂混合，在后续PCR扩增程序时，能够 很好地溶解引物，且对于扩增程序不会带来影响，使其能清晰的显示出扩增产物亮带。
[0006] 本发明还公开了采用所述试剂盒检测西瓜枯萎病菌的方法，该方法包括如下步 骤，（1)提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA ;
[0007] ⑵采用检测试剂盒对（1)步分离出的DNA进行PCR扩增；
[0008] (3)将6 μ 1步骤（2)的PCR扩增产物用质量浓度为1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离， 分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下，根据扩增产物的大小判定结果，当特异性地扩增出 491bp产物时，即可判断植物组织中存在西瓜枯萎病菌。
[0009] 作为优选的实施例，所述步骤（1)的提取方法包括如下步骤：①取250mg西瓜枯 萎病菌菌体液氮、石英砂充分碾磨成白色粉末状，装入IOml离心管；在离心管中加入4ml 65°C预热的CTAB提取液、60 μ 1 β -巯基乙醇，剧烈振荡至样品分散均匀；再将离心管65°C 水浴45min，其间颠倒2?3次；加入0. 25体积的无水乙醇和0. 11体积的5mol/L醋酸钾， 充分混匀，于冰上放置Ih;
[0010] ②经①步处理后将上述混合物于55?60°C水浴I. 5h，每IOmin颠倒混勾一次，水 浴1. 5小时后离心15min，离心速度为12, OOOrpm ;
[0011] ③离心后取上清液加入与上清液等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合 溶液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为：25 : 24 : 1，离心5min，离心速度为12, OOOrpm ;
[0012] ④经③步离心后取上清液，即水相，加入等体积氯仿抽提一次，离心5min，离心速 度为12,000rpm，收集上清液；
[0013] ⑤向④步上清液加入0. Iml的质量浓度为3m01/L NaAC溶液和2ml的-20°C无水 乙醇，-20°C下沉淀30min后12, OOOrpm离心5min，轻轻地倒去上清液；
[0014] ⑥向⑤步弃去上清液的沉淀部分加入700 μ 1体积浓度70 %的-20°C乙醇进行洗 涤，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用IXTE溶液进行溶解，得到菌株的DNA溶液，用 紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μ 1待用。所述步骤（1)利用改良的CTAB 法提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA时，该方法和传统用于真菌基因组DNA提取的 CTAB法相比，其得到的基因组DNA更加完整，其检测的电泳条带更加清晰。
[0015] 进一步的，所述步骤①中的CTAB提取液包括质量浓度为2%的CTAB，lOOmmol/L、 pH 8. 0 的 Tris-HCl，20mmol/L、ρΗ8· 0 的 EDTA，L 4mol/L 的 NaAC。
[0016] 所述步骤⑵的扩增方法包括：①取⑴步的DNAl μ 1，将其与试剂盒的试剂混 合；
[0017] ②将①步的混合物放入PCR仪器中进行扩增，PCR扩增程序为：94°C预变性5min ; 94°C变性 40sec ;60°C退火 30sec ;72°C延伸 IOOsec ;30 个循环最后 72°C延伸 lOmin。
[0018] 本发明方法适用于植物组织样品中西瓜枯萎病菌的快速可靠检测和鉴定，对于农 业生产中西瓜枯萎病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具 有以下的技术优势和积极效果：
[0019] 1、精确度高：本发明检测方法是利用比较基因组学方法对西瓜枯萎病菌和其他枯 萎病菌的全基因组序列进行分析得到西瓜枯萎病菌的特有片段，根据特异片段设计引物进 行检测。已经对源于来自我国北京、山西省及国外的西瓜枯萎病菌和尖孢镰刀菌近缘种及 其他常见病菌的验证，本发明设计的特异性引物具有很强的特异性，因此能够高精准度地 检测出西瓜枯萎病菌；
[0020] 2、操作简便：本发明采用的技术方案是在生物分子层面上进行的检测，传统的检 测方法，需要生物学的专家以形态特征进行检测，因此本发明操作简便，可用于带西瓜枯萎 病菌的植物组织的高灵敏度快速分子检测，满足对发病植物组织中存在的西瓜枯萎病菌进 行快速可靠的检测和鉴定的需要。
【附图说明】
[0021] 图1、本发明和传统的CTAB法提取真菌基因组DNA电泳图；
[0022] 图中，1，2为传统CTAB法提取的真菌基因组DNA ;3,4本发明提取的真菌基因组 DNA ；
[0023] 图2、根据特异片段设计的不同引物PCR扩增出的产物对比图；
[0024] 图中，条带从上往下依次对应 5kb、3kb、2kb、lkb、750bp、500bp、250bp、，100bp，M : Trans2kplus marker ;1_14分别对应着设计的14对特异引物对西瓜枯萎病菌基因组DNA进 行扩增的电泳图；
[0025] 图3、利用PCR对12组双重检测引物进行筛选结果的电泳图；
[0026] 图中，M :Trans2kplus marker ;1-12为12组双重检测引物集PCR的电泳图，每组 双重检测引物集中包含一对枯萎病菌通用引物对及筛选的西瓜枯萎病菌特异引物对；
[0027] 图4、本发明双重检测引物对各种枯萎病菌检测的电泳图；
[0028] 图中，M :Trans2kplus marker ;Fuw_BN3 :西瓜枯萎病生理小种 0# ;1_1，1-5， 1-9 :西瓜枯萎病生理小种1# ;2-1，2-2,2-3 :西瓜枯萎病生理小种2# ;A5-beans :枯萎病 菌菜豆专化型；F-pepper-Fl :枯萎病菌辣椒专化型；Foc-banana-4 :枯萎病菌香蕉专化 型；cotton :枯萎病菌棉花专化型；Fuc-BN-8 :枯萎病菌黄瓜专化型；F-eggplant-Fll : 枯萎病菌前子专化型；F-tomato-DBl :枯萎病菌番前专化型；Lettuce :枯萎病菌萬苣专 化型；Foc :枯萎病菌甘蓝专化型生理小种1# ;58 :枯萎病菌甘蓝专化型生理小种2# ; Botrytis cinerea :灰霉菌；T30-4 :叶霉菌；Rhizoctonia :丝核菌；Pythium :腐霉菌； Colletotrichum :炭疽菌；ddH20 :清水对照；
[0029] 图5、不同退火条件下Fom引物的扩增电泳图；
[0030] 图中，M :Trans 3k maker，其条带从上往下依次对应 3kb，2kb，lkb，750bp，500bp， 250bp，IOObp ; 1-11 分别为 PCR 退火温度 65 °C，62 °C，60 °C，58 °C，57 °C，56 °C，55 °C，54 °C， 52°C，5(TC，48°C。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例进一步说明本
【发明内容】
，需要说明的是，在没有特殊说明的情况 下，本