一种基于双功能探针基因芯片检测方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及属于基因芯片质量控制领域的应用方法，具体涉及一种基于双功能探针基因芯片检测方法。
[0002]【背景技术】:
基因芯片技术作为近年来快速发展的一项生物高新技术，为解决怎样研究基因在生命过程中所担负的功能提供了光辉的前景。基因芯片技术是指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品序列信息。
[0003]与传统核酸印迹杂交方法相比，基因芯片同时将大量根据靶基因的特征及检测要求预先设计好的探针固定在支持物表面，一次杂交可检测和分析样品中多种靶基因的相关信息，解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足，使基因芯片技术具有了高通量、多参数同步分析，快速全自动分析，高精确度分析，高灵敏度分析的特点。但用荧光标记的PCR产物与匹配探针杂交对未知DNA序列片段进行检测的方法本身也存在缺陷:
I)基因芯片荧光检测主要依赖于检测结果的荧光强度，没有荧光强度或者荧光强度弱的即判断为阴性，但在阴性的结果中无法确定是否是探针固定上；2)多种基因芯片技术平台得到的研究结果不一致，因此基因芯片的有效性控制已成为目前基因技术研究的热点，尤其是应用型基因芯片尚无一些准确、高效地有效性检测方法，其应用的推广尚有困难。因此发展一种准确、高效地有效性检测方案来检测探针是否固定成为一种迫切的需要。
[0004]基因芯片有有效性控制方案包括基因芯片探针、支持物制备的有效性控制、探针在支持物上的固定效率即基因芯片制备的有效性控制，以及基因芯片检测时的有效性控制、检测结果的标准化等一系列问题。本专利主要针对的是制备有效性的基因芯片。
[0005]制备有效性基因芯片的传统方法有以下几种:1)利用荧光DNA染料对单链DNA探针染色，根据荧光DNA染料强度来估计芯片的有效性；2)利用目的探针3点样液和带荧光I质量控制探针8点样液分别点样于修饰了手臂分子6的基质7上，形成各自的斑点，然后使目的探针3在目斑点处与带有同种或异种荧光2的待测DNA序列5杂交，根据质量探针8点样位置是否发荧光，估计芯片的有效性，根据目的探针点位置是否发荧光，判定待测DNA序列信息，如图1所示。但是以上的这些方法都无法直接、有效地评价芯片制备的质量。
[0006]这些传统基因芯片有效性控制控制的方法可减少了基因检测中假阳性结果出现的可能性，在一定程度上提高了检测结果的准确性，但传统的基因芯片有效性控制检测，只是把一定浓度的质量控制探针固定在目的探针的周围，质量控制探针与目的探针分开点样于基片上，没有考虑到目的探针与待测DNA序列的杂交通常位于固相表面，有一定程度的空间阻碍，若目的探针浓度过高，导致目的探针固定不上去，所以通常传统基因芯片的缺陷是其自身质量无法得到较好的控制，本发明提出了一种基因芯片有效性控制方法，能够对基因芯片的有效性进行控制，大大提高其检测的可靠性。
[0007]
【发明内容】
: 针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于双功能探针基因芯片检测方法，能较直接地检测探针是否固定在基片上，以排除因探针缺失而造成的阴性结果出现的可能性，提闻了基因芯片检测的准确性和可罪性。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
本发明基于双功能探针基因芯片检测方法，包括以下几个步骤:
步骤一:样品制备:
制备含有目的探针和寡聚体序列一段序列片段，并且用第一荧光基团标记中寡聚体序列的任意碱基，然后将其制备成点样溶液。
[0009]步骤_.:基因芯片制备
将上述点样溶液点样于修饰了手臂分子的基片上形成N个探针斑点，N为自然数，经过固定并清除未固定的探针，完成基因芯片的制备。
[0010]步骤三:检测目的探针通过手臂分子固定在基片上:
检测上述所有探针斑点发出的荧光信号，若在第一荧光基团的激发波长下检测到荧光，则表示目的探针通过手臂分子固定在基片上，从而判定基因芯片质量合格。
[0011]否则，若任一个探针斑点在第一荧光基团的激发波长下未检测到荧光，则表示目的探针未通过手臂分子固定在基片上，判定为基因芯片质量不合格。
[0012]本发明基于双功能探针基因芯片检测方法，还包括以下步骤:
步骤四:杂交:
将第二荧光基团标记的待测序列与与质量合格基因芯片上所述的探针斑点中的目的探针3进行杂交，杂交后，目的探针中的探针和待测序列结合形成杂交产物。
[0013]步骤五:确定待测序列的序列信息:
对所述杂交产物进行荧光信号检测，若在第二荧光基团的激发波长下检测到荧光，则确定目的探针与待测序列互补，并确定待测序列的序列信息。
[0014]若在第二荧光基团(2)的激发波长下未检测到荧光，则表示不能确定目的探针
(3)与待测序列(5)互补，无法确定待测序列(5)的序列信息。
[0015]所述的手臂分子可在目的探针和寡聚体序列的任意碱基位置。
[0016]所述的目的探针可以是脱氧核糖核酸，核糖核酸或者肽核酸。
[0017]所述的基片可以是玻璃片、硅胶晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、微型磁珠或者管盖。
[0018]所述的第一荧光基团和所述的第二荧光基团可为Cy3、Cy5、Fite, FAM或者Rhodamine，但是所述的第一荧光基团和所述的第二荧光基团使用时不相同，并且在检测时两种荧光基团的荧光发射峰要大于40nm的差异，防止两者在检测时由于吸收峰重叠而无法正确得出结果。
[0019]所述的第一荧光基团(I)和第二荧光基团(2)为生物素-亲和素与标记物质结合的复合物。
[0020]所述的标记物质为荧光蛋白、铁蛋白、胶体金、荧光素或化学发光物质。
[0021]本专利所提的目的探针是一段已知的核酸或核酸类似物序列片断，并在核酸或核酸类似物链上修饰了活性基团，可通过化学反应固定在被修饰手臂分子的基底上；寡聚体序列是一段已知的、较短的核酸或核酸类似物序列片断；待测序列是一段未知的核酸或核酸类似物序列片断，末端标记了发光基团或标记复合物；手臂分子是多个碳原子组成两端均含有活性基团的小分子有机化合物，一端活性基团可与基底发生化学反应，另一端活性基团可与修饰了活性基团的核酸或核酸类似物链发生化学反应。
[0022]与现有技术相比，本发明具有的有益效果是:
O目的探针与待测DNA序列杂交通常位于固相表面，并且分子大小均为纳米级，存在一定的界面效应，使得杂交所需离子浓度较少；本发明若手臂分子与寡聚核苷酸序列末端碱基相连，那么杂交就会相对远离固相表面，相应的界面效应也会减小，使得探针与样品更容易杂交。若手臂分子与寡聚体序列的第二或第三位碱基相连，则与可为探针与样品杂交预留空间，减少空间位阻，同样有利于目的探针与待测DNA序列杂交。
[0023]2)本发明将检测芯片有效性的第一种荧光标记直接连接到目的探针，点样在基片上，通过手臂分子固定于基片上，这样不仅实时监测目的探针是否固定于基片上，也可精确定位出目的探针的位置。
[0024]3)本发明目的探针与质量控制探针相对独立，目的探针只与待测样品片段结合，不与质量控制探针形成竞争关系，目的探针的检测并不依赖于目的探针与质量控制探针杂交的效率，因此探针与样品片段的结合效率不会受到影响。
[0025]4)本发明基因芯片有效性控制方法，若应用于基因芯片制备中，则能够大大提高基因检测结果的准确性及可靠性；同时，不仅可以为基因芯片的制造者提供有效性控制的方法，提高生产质量，又可以为基因芯片的使用者在使用之前对芯片做出评价，简单有效地查出实验中可能出现的问题，从而减少了实验中的分析过程，提高了实验效率。
【附图说明】
[0026]图1是现有技术中的基因芯片有效性控制方法的结构示意图；
图2是本发明的基于双功能探针基因芯片检测方法的整体结构示意图；
图3是本发明的基于双功能探针基因芯片检测方法的第一荧光基团放在目的探针和寡聚体序列之间、手臂分子结合在目的探针和寡聚体序列末端结构示意图；
图4是本发明的基于双功能探针基因芯片检测方法的第一荧光基团放在目的探针和寡聚体序列末端、手臂分子结合目的探针和寡聚体序列之间结构示意图。
[0027]图中:1、第一荧光基团，2、第二荧光基团，3、目的探针，4、寡聚体序列序列，5、待测DNA序列，6、手臂分子，7、基片，8、质量控制探针。
【具体实施方式】
[0028]下面将结合附图对本发明作进一步说明。
[0029]本发明的基于双功能探针基因芯片检测方法，包括以下几个步骤:
1、样品制备:
如图2、3、4所示，制备含有目的探针3和寡聚体序列4 一段序列片段，并且用第