可检测与区分不同种羊巴贝斯虫的引物对与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于快速检测与区分动物血液原虫病的试剂盒。确切讲本发明涉及一种不仅能用于检测，而且能准确区分我国分布的两种感染羊的巴贝斯虫，即莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]羊的巴贝斯虫病是一种经蜱传播的血液原虫病，由绵羊巴贝斯虫、莫氏巴贝斯、粗糙巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种等引起，使感染动物出现发热、黄疸、贫血、血红蛋白尿、甚至死亡。该病在热带、亚热带、温带均有流行，给世界畜牧业造成严重的危害。其中绵羊巴贝斯虫{Babesia, ον is)与莫氏巴贝斯虫(B.motasi)是引起羊巴贝斯虫病的主要病原；绵羊巴贝斯虫虫体小，对小反刍动物致病力高，传播媒介是囊形扇头蝶(Uilenberget al.，1980)。莫氏巴贝斯虫虫体较大,刻点血蝶为其传播媒介(Alani and Herbert,1988; Uilenberg et al.，1980)。粗糙巴贝斯虫(汉是一种大型的非致病性的巴贝斯虫，与莫氏巴贝斯虫和绵羊巴贝斯虫在形态、血清学、分子进化方面有很大差异(Hashem1-Fesharki and Uilenberg, 1981; Schnittger et al., 2003)。
[0003]在我国，羊的巴贝斯虫病最早在1982年和1986年由陈德明和赵锡荣等分别在四川和黑龙江省发现并报道，当时并未引起兽医防治部门的重视。自1997年以来，笔者所在实验室，即中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫与虫媒病团队先后对我国部分省区羊的巴贝斯虫病进行了选点调查，采用血液接种和蜱传播试验的方法先后自辽宁、河北、甘肃和新疆等省份分离获得了羊的巴贝斯虫不同地方株，并发现这些地区该病流行比较严重，病原对外地引进良种羊致病性较强，严重制约了羊的品种改良。依据真核生物核糖体18S rRNA和ITS基因的特点，设计合适的引物，对这些地方分离株进行测序分析，序列比对结果显示:这些感染羊的巴贝斯虫可分为两组；一组为莫氏巴贝斯虫(包括莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫宁县株、莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫麻当株和莫氏巴贝斯虫河北株)，另一组为羊巴贝斯虫未定种新疆株(Guan et al., 2009; Liu et al., 2007b;Niu et al., 2009a)。另外，经传播实验证实，莫氏巴贝斯虫宁县株和临潭株的传播媒介为青海血蝶和长角血蝶(Baietal.，2002; Guan et al., 2010c);羊巴贝斯虫未定种新疆株的传播媒介为小亚璃眼蜱。这三种蜱在我国广范分布(Chen et al.,2010; Yin andLuo, 2007;陈泽等，2008;邓国藩，1960);同时，还建立了各种分子生物学和血清学检测技术，通过流行病学调查显示，在中国，羊巴贝斯虫病的感染率为I 1.2%?3 1.7%,在甘肃甘南牧区高达8 2.3 8 %(Guan et al, 2012)。且我国分离的感染羊的巴贝斯虫，即莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株在流行区内常呈混合感染或隐性感染状态，不同病原之间的鉴别诊断一直是困扰该病流行病学调查的技术瓶颈。
[0004]目前常用的诊断该病的方法为血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。还有很多血清学方法，但都存在一定的假阳性或假阴性以及交叉反应。分子生物学诊断方法有套式PCR检测方法，LAMP检测方法(Guan et al., 2010e ；Guan et al, 2012)，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染，LAMP检测过程中容易出现假阳性。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种可克服现有技术的不足，能快速、特异、灵敏的检测绵羊、山羊和自然媒介蜱体内羊巴贝斯虫感染，而且能准确区分我国分布的两种感染羊的巴贝斯虫，即莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对及试剂盒。
[0006]本发明的可用于检测羊莫氏巴贝斯虫的引物对基因序列为:SEQ ID N0.1和SEQID N0.2。本发明的可用于检测羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对基因序列为:SEQ IDN0.4 和 SEQ ID N0.5。
[0007]本发明的可检测与区分羊莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的试剂盒内包括有:a)用于检测羊莫氏巴贝斯虫的引物对SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2, b)可用于检测羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5, c)荧光探针序列Motas1-Prob和d)荧光探针序列OBXJ-Prob，其中荧光探针SEQ Na 3和SEQ Ns 6的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有荧光猝灭基团BHQl。
[0008]为方便使用，本发明的可检测与区分羊莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的试剂盒中还可有特异性检测羊莫氏巴贝斯虫的标准阳性质粒模板PGEM-Teasy-1SSrRNABLT，特异性检测羊巴贝斯虫未定种新疆株的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18SrRNABXJ，适用于两种检测方法的公用试剂荧光定量PCR反应液及阴性质控标准品。
[0009]在本发明应用时的扩增条件是:扩增羊莫氏巴贝斯虫的反应条件为:95°C预变性30s，然后95°C 5s,56°C 10s、72°C 30s，45个循环；扩增羊巴贝斯虫未定种新疆株的反应条件为 95°C预变性 30s，然后 95°C 5s、61°C 10s、72°C 30s，45 个循环。
[0010]本发明实际上是一种利用核糖体18S rRNA基因检测与区分绵羊、山羊和自然媒介蜱体内羊巴贝斯虫的实时荧光定量PCR方法。实时荧光定量PCR( real- time fluorescentquantitative polymerasechain react1n, real-time FQ-PCR)技术于 1996 年由美国Applied B1systems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR技术相比，它具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快和全封闭反应等优点，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。目前，国内尚无检测与区分两种感染羊的巴贝斯虫，即莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的实时荧光定量PCR方法的报道。由于自然界中媒介蜱与宿主的关系非常复杂，且每种病原都能独立的引起疾病，其混合感染和隐性感染的现象比较多。对流行区内放牧羊群和自然界存在媒介蜱感染状况进行调查过程中，如何提高检测的快速性与敏感性和对不同病原进行鉴别诊断是巴贝斯虫流行病学研究的弱点问题。
[0011]本发明利用梨形虫(巴贝斯虫和泰勒虫)常用来做为鉴别诊断的靶标基因核糖体18S rRNA基因，该基因在梨形虫中高度保守，但在不同虫种之间存在可变区，本发明准确利用该基因的这一特点，将作为实时荧光定量PCR检测的靶标基因，分别设计针对莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的特异性引物和探针，两对引物和探针不但能特异性的检测感染羊的莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株；而且能准确区分这两种巴贝斯虫，可作为鉴别诊断莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的方法。且特异性较好，未能检测到感染羊的其它相关病原，最主要是这两种巴贝斯虫之间没有交叉反应，检测结果良好。从而提供了一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测与区分我国感染羊的两种巴贝斯虫的鉴别诊断方法，填补了技术空白。本发明中，所用的检测莫氏巴贝斯虫的特异性引物和探针虽然是通过莫氏巴贝斯虫临潭株的18S rRNA基因设计的，但该引物和探针也适用于其它几株莫氏巴贝斯虫(如莫氏巴贝斯虫宁县株、莫氏巴贝斯虫天祝株和莫氏巴贝斯虫河北株)，检测羊巴贝斯虫未定种新疆株的特异性引物和探针是通过羊巴贝斯虫未定种新疆株的18S rRNA基因设计的，它只能特异性的检测到羊巴贝斯虫未定种新疆株，而无法检测到其它几株莫氏巴贝斯虫。通过对实时荧光定量PCR反应条件的优化，使本发明具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于检测与区分绵羊、山羊和自然媒介蜱体内两种感染羊的巴贝斯虫一莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株。
[0012]本发明采用荧光定量PCR诊断技术，因其具有灵敏度高、速度快、特异性强等优点在病原体的定性和定量检测方面有独特的优势，且使用本发明的试剂盒时是在封闭体系中进行扩增和实时检测，因此可以避免环境污染，缩短检测时间，尤其适用于急性及亚临床感染的大批量样品的检测与诊断。
【附图说明】
[0013]图1莫氏巴贝斯虫实时荧光定量PCR特异性扩增曲线。
[0014]图2莫氏巴贝斯虫实时荧光定量PCR敏感性扩增曲线。
[0015]图3莫氏巴贝斯虫实时荧光定量PCR敏感性检测的标准曲线。
[0016]图4羊巴贝斯虫未定种新疆株实时荧光定量PCR特异性扩增曲线。
[0017]图5羊巴贝斯虫未定种新疆株实时荧光定量PCR敏感性扩增曲线。
[0018]图6羊巴贝斯虫未定种新疆株实时荧光定量PCR敏感性检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0019]本发明的试剂盒中最主要的是检测莫氏巴贝斯虫的如下两条引物和一条探针序列，即 SEQ ID N0.1Motas1-S (正向引物):5’ -ACCTCTGAACGTAACAAAC-3’ ；SEQ ID N0.2Motas1-AS (反向引物):5’ -CACGGAGCAACAGTAGAA-3’ ；SEQ ID N0.3 Motas1-Prob (荧光探针):5’ (FAM) -CTACAGCACACGCTCCAACG- (BHQl) 3’。检测羊巴贝斯虫未定种新疆株的如下两条引物和一条探针序列，即 SEQ ID N0.4 OBXJ-S (正向引物):5’-AGACCTCTGAACGTAACC-3’；SEQ ID N0.50BXJ-AS(反向引物):5，-GCTG