六种猪病毒多重实时荧光定量pcr快速诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种六种猪病毒多重实时荧光定量 PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测猪圆环病毒II型（PCV2)，猪细小病毒 (PPV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)，猪瘟病毒（CSFV)，猪流行性腹泻病毒（PEDV)和 伪狂犬病病毒（PRV)六种猪病毒，适用于临床及科研中对六种猪病毒的快速定量检测。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着养猪业向规模化和集约化方向发展，猪群发生多病原混合感染及继 发感染的情况越来越普遍。感染猪细小病毒（PPV)、猪流行性腹泻病毒（PEDV)、猪繁殖与呼 吸综合症（PRRSV)、伪狂犬病病毒（PRV)、猪瘟病毒（CSFV)、猪圆环病毒II型（PCV2)这几种 疾病在临床上呈现出相似的呼吸和繁殖障碍的症状，并且它们常常呈混合感染，而且上述 疾病的发生使对其它疾病如猪流行性腹泻的诊断变得复杂和困难，死亡率很高，给养猪业 造成重大损失。
[0003] 猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV)是目前已知的最小的动物病毒。PCV具 有PCVl和PCV2两种基因型，PCVl无致病性，PCV2有致病性可引起猪断奶后多系统衰竭综 合征（PMWS)、猪呼吸道传染疾病、猪繁殖系统障碍等疾病。在哺乳期和育成期的猪最易感染 此病，流行病学调查表明，PCV2广泛存在于世界各国的猪群中，临床上易与猪呼吸与繁殖综 合征病毒（PRRSV)，猪细小病毒（PPV)等其他病原混合感染，表现出多种临床症状和病理变 化。
[0004] 猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV)在1967年首次发现于英国，目前世界各 个国家均有发现。PPV感染导致的临床症状为胚胎和胎儿死亡、母猪流产、死胎和木乃伊胎 等，是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。近年 来，PPV感染呈扩大上升趋势，并呈现出许多新的流行特点，给养猪业造成巨大的经济损失。 研宄发现，由PPV引起母猪繁殖障碍疾病与感染PRRSV、CSFV等病毒引起的症状难以区别诊 断，给PPV的防治带来了一定的困难。
[0005] 猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要症状 的传染病，并伴随高死亡率，该病于1987年在美国和加拿大首次发现，现在遍布世界各个 养猪国家。临床表现为母猪繁殖障碍，呈现流产、早产、死胎、木乃伊胎及子猪成活率下降等 病症。我国1996年首次报道该病的存在，临床和血清调查显示，该病在我国普遍存在，且近 年来呈流行态势。
[0006] 猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV)是一种世界性范围高度接触性 传染病，可导致妊娠母猪流产，木乃伊胎、畸胎，死产等症状是引发猪瘟的病原。猪瘟的高致 病率和高死亡率给养猪业造成了巨大的经济损失，近十年来它的流行和发病特点发生很大 变化，呈非典型化态势，临床症状缺乏规律，严重威胁着养猪业的发展。
[0007] 伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV)是引发伪狂犬病的主要病原，可以感 染多种家畜和野生动物。对猪的危害极为严重，感染后可引发妊娠母猪流产、产死胎、弱仔 及木乃伊胎等症状。该病在猪群中具有死亡率高、传播速度快、流行范围广等特点，我国自 1947年首次报道以来，现己扩展到全国二十几个省市，给我国畜牧业特别是养猪业造成了 巨大的经济损失。
[0008] 猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征 的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可 达100%。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在 2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了 我国养猪业的健康发展。
[0009] 常规的病原学和血清学检测很难将这些疾病同时加以区别鉴定，同时又存在操作 繁琐、费时费力、敏感度低等缺陷，尤其是多种病原感染时，难以有效进行早期检测，容易产 生误判错判。而多重实时荧光定量PCR技术可以一次同时检测多种病原体，并具有高特异 性和敏感性、检测时间短、检测成本低等优点，是一种较为理想的检测方法。因此，开发出一 种同时特异检测多种猪病毒感染的多重实时荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，有助于提 升病毒检测水平，在疾病诊断和防治及食品安全等方面具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题是提供一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊 断试剂盒。
[0011] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速 诊断试剂盒：
[0012] 包括如下6对PCR引物（为六种病毒特异性引物）：
[0013] PCV2-F ：CGAGAAAGCGAAAGGAA,
[0014] PCV2-R ：ACTCGATCAGTAAGTTGCC ；
[0015] PPV-F ：GCGTTAGAATAGGATGCGAGGAA,
[0016] PPV-R ：CGCAAGTCCAAAATCACCTGGC ；
[0017] PRRSV-F ：TGATAGCACAGCTCCACAGA,
[0018] PRRSV-R ： CCGCGACTTACCTTTAGAGC ；
[0019] PEDV-F ：TGGCATTTCTACTACCTCG,
[0020] PEDV-R ：AGTGGGTTCAGTCTTTGC ；
[0021] PRV-F ：CGACGGCGTGAACATCCT ；
[0022] PRV-R ：GAACTTGTACGTGCGGTGCT ；
[0023] CSFV-F:GCTCCCTGGGTGGTCTAAG ;
[0024] CSFV-R:CTCGTCCACATAGCATCTCG。
[0025] 作为本发明的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒的改进：
[0026] 所述试剂盒包括：a)、荧光定量PCR反应液、b)、阳性对照品、c)、阴性对照品和d)、 定量PCR标准品；
[0027] a)、所述荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶（酶混 合物）、六种病毒特异性引物；
[0028] 所述PCR反应缓冲液包括缓冲液，氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；
[0029] 备注说明：酶混合物含RNA酶抑制剂，M-MuLV逆转录酶和耐热DNA聚合酶；
[0030] b)、所述阳性对照品为：含PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV六种病毒的阳性质 粒混合品（每种病毒浓度约为300ng/ μ 1);
[0031] c)、所述阴性对照品为：灭菌后焦碳酸二乙酯处理水（DEPC-H2O);
[0032] d)所述定量PCR标准品由以下6种标准品组成：
[0033] PCV2标准品、PPV标准品、PRRSV标准品、CSFV标准品、PEDV标准品、PRV标准品。
[0034] 备注说明：
[0035] 上述六种病毒标准品序列如下：
[0036] 所述PCV2标准品序列为：
[0037] CGAGAAAGCGAAAGGAACAGATCAGCAGAATAAAGAATACTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTGATCGA GTGTGGAGCTCCTAGATCTCAGGGACAACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTC TGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAACGTGAGC GGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACTAATGTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGTAAAAGCAAATG GGCTGCTAATTTTGCAGACCCGGAAACCACATACTGGAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACCo
[0038] PPV标准品序列为：
[0039] AAAGTTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATA AACCTAACCAGAAAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTGAATGGCCACTAATATGTGCTTGGTTGGT AAAGAAAGGTTACCAAGCAACAATGGCTAGCTATATGCATCATTGGGGAAATGTACCTGATTGGTCAGAAAAATGGG AGGAGCCAAAAATGCAAACCCCAATAAATACACCAACAGACTCTCAGATTTCCACATCAGTGAAAACTTCGCCAGCG GACAACAACTACGCAGCA