通过抑制脑源神经营养因子(bdnf)的天然反义转录物治疗bdnf相关疾病的制作方法
【专利说明】通过抑制脑源神经营养因子（BDNF)的天然反义转录物治 疗BDNF相关疾病
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月15日提交的美国临时专利申请系列号61/611，225和2012 年3月23日提交的美国临时专利申请系列号61/614, 664的利益，这两者全文通过引用并 入本文。 发明领域
[0003] 本发明的实施方案包括调节BDNF和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。
【背景技术】
[0004] DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面（包括DNA复制、转录和翻译） 而言为重要的。杂交对于探测特定核酸或者改变其表达的各种技术而言亦为主要的。反义 核苷酸例如通过与靶RNA杂交来扰乱基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反 义DNA具有DNA-RNA杂合体充当核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，该核糖核酸酶H消 化活性存在于大多数细胞类型中。可将反义分子递送到细胞中，这与寡脱氧核苷酸（ODN) 的情况一样，或者它们可作为RNA分子由内源基因表达。FDA最近批准了一种反义药物， VITRAVENE?(用于治疗巨细胞病毒视网膜炎），这反映了反义物具有治疗应用。
[0005] WO 2010/093904及其美国对应申请US/2011/0319475公开了 BDNF作为使用本文 所述的寡核苷酸调节的靶标。存在着针对天然反义靶标进行持续开发和与这种靶标互补并 调节BDNF蛋白表达以潜在地治疗BDNF相关疾病和病症或用于与治疗BDNF相关疾病和病 症有关的研宄中的新开发寡核苷酸的需要。
[0006] 发明概述
[0007] 提供本概述以呈现本发明的概要，从而简要地指出本发明的性质和实质。在理解 以下的情况下提出本概述：其不会用于解释或限制权利要求的范围或含义。
[0008] 在一个实施方案中，本发明提供通过使用靶向于天然反义转录物的任何区域的反 义寡核苷酸来抑制天然反义转录物的作用，从而引起哺乳动物生物体中相应BDNF有义基 因的上调的方法。本文也考虑本文所述的天然反义转录物的抑制可通过siRNA、核酶和小分 子来实现，其认为在本发明的范围之内。
[0009] -个实施方案提供在体内或体外调节生物系统（包括，但不限于患者细胞或组 织）中的BDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为约5-约30个核 苷酸的反义寡核苷酸接触所述生物系统或所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与以下多核 苷酸的反向互补序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :3的核 苷酸 1-1279 或 SEQ ID NO:4 的核苷酸 1-1478 或 SEQ ID NO:5 的核苷酸 1-1437 或 SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364 或 SEQ ID N0:9 的核苷酸 1-3136 或 SEQ ID NO: 10 的核苷酸 1-906 或 SEQ ID NO: 11 的核 苷酸1-992之内的5-30个连续核苷酸，从而在体内或体外调节所述生物系统包括所述患者 细胞或组织中BDNF多核苷酸的功能和/或表达，条件是排除具有SEQ ID NO: 50-55的寡核 苷酸。
[0010] 在一个实施方案中，上述的寡核苷酸靶向于生物系统中存在的BDNF多核苷酸的 天然反义序列，例如SEQ ID NO :3-11所示的核苷酸，以及其任何变体、等位基因、同源物、突 变体、衍生物、片段和互补序列。这类反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO :12-49所示。
[0011] 在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中BDNF多核苷酸的功能或表达 的方法，包括用靶向于BDNF多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸接触所 述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO :3的核苷酸1-1279或SEQ ID NO: 4的 核苷酸1-1478或SEQ ID NO: 5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO: 6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136 或SEQ ID NO: 10的核苷酸1-906或SEQ ID NO: 11的核苷酸1-992之内的5-30个连续核 苷酸，从而调节所述生物系统中BDNF多核苷酸的功能和/或表达。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中BDNF多核苷酸的功能或表达 的方法，包括用靶向于BDNF多核苷酸的天然反义转录物的区域的至少一种反义寡核苷酸 接触所述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO :3的核苷酸1-1279或SEQ ID N0:4的核苷酸1-1478或SEQ ID N0:5的核苷酸1-1437或SEQ ID N0:6的核苷酸1-2322 或SEQ ID NO: 7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷 酸1-3136或SEQ ID NO: 10的核苷酸1-906或SEQ ID NO: 11的核苷酸1-992之内的5-30 个连续核苷酸，从而调节所述生物系统中BDNF多核苷酸的功能和/或表达。
[0013] 在一个实施方案中，本发明包括提高生物系统中具有SEQ ID N0:1和2的BDNF多 核苷酸的功能和/或表达的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反义转录物的 至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO :3的核 苷酸 1-1279 或 SEQ ID NO:4 的核苷酸 1-1478 或 SEQ ID NO:5 的核苷酸 1-1437 或 SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364 或 SEQ ID N0:9 的核苷酸 1-3136 或 SEQ ID NO: 10 的核苷酸 1-906 或 SEQ ID NO: 11 的核 苷酸1-992之内的5-30个连续核苷酸，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的功能 和/或表达。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明包括提高生物系统中具有SEQ ID N0:1和2的BDNF 多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反义转录物的 至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的 功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID N0:3-ll。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明包括提高生物系统中具有SEQ ID N0:1和2的BDNF 多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反义转录物的 至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的 功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID N0:3-ll和其中所述反义寡核苷酸 选自SEQ ID NO: 12-49的至少一种。
[0016] 在一个实施方案中，组合物包含一种或多种与有义和/或反义BDNF多核苷酸结合 的反义寡核苷酸。
[0017] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰或取代的核苷酸。
[0018] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰的键。
[0019] 在又另一个实施方案中，所述修饰的核苷酸包含经修饰的碱基，其包括硫代磷酸 酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2'-0-甲基、氟或碳、亚甲基或其他锁核酸（LNA)分子。优选地，所 述修饰的核苷酸为锁核酸分子，包括a -L-LNA。
[0020] 在一个实施方案中，将所述寡核苷酸经皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用于患者。
[0021] 在一个实施方案中，将所述寡核苷酸在药物组合物中施用。治疗方案包括至少一 次向患者施用反义化合物；然而，可将此治疗修改成在一段时间内包含多个剂量。所述治疗 可与一种或多种其它类型的疗法组合。
[0022] 在一个实施方案中，将所述寡核苷酸封装到脂质体中或连接于载体分子（例如胆 固醇、TAT肽）。
[0023] 在一个实施方案中，本发明包括SEQ ID Ν0:50-55作为靶向于天然反义转录物 (NAT)的寡核苷酸调节BDNF多核苷酸的表达的用途，其中所述NAT选自SEQ ID ΝΟ:3-11。 在另一个实施方案中，本发明包括SEQ ID Ν0:50-55作为靶向于天然反义转录物（NAT)的 寡核苷酸调节BDNF多核苷酸的表达的用途，其中所述NAT选自SEQ ID N0:3、4、5、7、8、9、10 和11〇
[0024] 其它方面描述于下文。
[0025] 附图简要说明
[0026] 图la_e显示有义mRNA和蛋白质的反义介导的调节。图Ia显示，在用革E向于 BDNF-AS转录物的非重叠区域的三种siRNA寡核苷酸转染几种人和小鼠细胞系后，发生 BDNF转录物的敲减和上调。图Ib显示BDNF-AS靶向的siRNA施用后BDNF和BDNF-AS转录 物的内源表达的时程研宄数据。数据显示随着时间过去，BDNF-AS下调，且然后BDNF表达 上调且是可逆的。图Ic显示两种靶向于BDNF-AS转录物的siRNA显著增加通过ELISA测 量的BDNF蛋白，而乱序的siRNA或对照的非靶向siRNA不显著增加 BDNF蛋白。图Id显示 施用各种siRNA后使用ELISA和/或蛋白质印迹测量的BDNF的蛋白质水平。图Ie显示相 对于提高的寡核苷酸浓度（1〇_ 12-1〇_6Μ)与模拟对照相比的百分倍数变化。
[0027] 图2显示Bdnf上调提高神经元突起生长（neuronal outgrowth) 〇
[0028] 图3显不Bdnf-AS在体内调节Bdnf mRNA和蛋白质。
[0029] 图4显示体内Bdnf-AS的阻断引起神经元存活和增殖的增加。
[0030] 图5显示BDNF-AS敲减导致BDNF mRNA上调。
[0031] 图6显示Bdnf表达的转录后调节。
[0032] 图 7 显示 hBDNFAntagoNAT 抑制人 BDNF-AS 转录物。
[0033] 图8显示AntagoNAT抑制N2a细胞中的小鼠 Bdnf-AS转录物。
[0034] 图9显示BDNF-AS敲减既不改变TrkB的水平也不改变两个方向的BDNF相邻基因 (Let7C和KIF18A) :LIN7C和KIF18A分别是位于BDNF3'下游和5'上游的基因。
[0035] 序列表的说明：SEQ ID NO: 1 :人脑源神经营养因子（BDNF)，转录物变体3, mRNA. (NCBI登录号：NM_170735);SEQ ID N0:2:小鼠脑源神经营养因子（Bdnf)，转录物变体1， mRNA(NCBI登录号：NM_007540) ;SEQ ID N0:3:天然BDNF反义序列（转录物变体BTlA; NR_033313. I) ;SEQ ID N0:4:天然 BDNF 反义序列（转录物变体 BT2A;NR_033314. I) ;SEQ ID N0:5:天然 BDNF 反义序列（转录物变体 BT1B;NR_033315.1) ;SEQ ID N0:6:天然 BDNF 反义序列（转录物变体BT2B;NR_002832.2) ;SEQ ID N0:7:天然BDNF反义序列（转录物变 体 BTlC ;NR_033312. I) ;SEQ ID N0:8 :天然 BDNF 反义序列（BDNF-AS 变体）；SEQ ID N0:9 : 天然BDNF反义序列；SEQ ID NO: 10 :小鼠天然BDNF反义序列（小鼠 BDNF-AS变体I) ;SEQ ID NO: 11:小鼠天然BDNF反义序列（小鼠 BDNF-AS变体2) ;SEQ ID NO: 12-55:反义寡核 苷酸；SEQ ID NO:56-59 :分别反义寡核苷酸12-15的反向互补序列；SEQ ID NO:60-64 :分 别反义寡核苷酸42-46的反向互补序列；SEQ ID NO:65和66 :分析序列。LNA(2' -0, 4' -C 亚甲基锁核酸）：+A*或+T*或+O或+G* ;2' 0M(2' -0-甲基）：mU*或mA*或mO或mG* ; PS (硫代磷酸醋）：T*或A*或G*或c* ;RNA :rU或rA或rG或rC。
[0036] 详细说明
[0037] 参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述 许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员 将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来 实施本发明。本发明不受行为或事件的排序限制，因为一些行为可以不同的顺序进行和/ 或与其他行为或事件同时进行。此外，并非所有说明性的行为或事件对实施本发明的方法 都为必需的。
[0038] 本文公开的所有基因、基因名称和基因产物意图对应来自任何物种的同源物，对 该物种而言本文公开的组合物和方法为适用的。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠 的基因和基因产物。应当理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，意图此公开 仅为示范性的，并且除非其出现的上下文中明确指示，否则不应理解为限制。因此，例如，对 于本文公开的在一些实施方案中有关哺乳动物核酸和氨基酸序列的基因而言，意图包括来 自其他动物（包括，但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类）的同源和/ 或直向同源基因和基因产物。在一个实施方案中，所述基因或核酸序列为人的基因或核酸 序列。定义
[0039] 本文所用的术语仅以描述具体的实施方案为目的而不意图限制本发明。除非上下 文另有明确指示，否则本文所用的单数形式"一"、"一个"和"所述"也意图包括复数形式。 此外，就术语"包括的"、"包括"、"具有的"、"具有"、"含有"或其变型在详述和/或权利要求 中所用的程度而言，这类术语意图以类似于术语"包含"的方式是包涵性的。
[0040] 术语"约"或"大约"意为在由本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受误差 范围之内，这部分取决于该值是如何测定或确定的，即，测量系统的限制。例如，按照本领域 的实践，"约"可意为在1或大于1的标准偏差之内。或者，"约"可意为给定值的最多20%， 优选10%，更优选5%，和还更优选1 %的范围。或者，具体地关于生物系统或过程，该术语 可意为在值的一个数量级之内，优选在值的5倍之内，更优选在2倍之内。当本申请和权利 要求描述具体值时，除非另作说明，否则应假设术语"约"意为在具体值的可接受误差范围 之内。
[0041] 本文所用的术语"mRNA"意为目前已知的靶向于基因的mRNA转录物，以及任何可 阐明的其它转录物。
[0042] "反义寡核苷酸"或"反义化合物"意为与另一个RNA或DNA (靶RNA、DNA)结合的 RNA或DNA分子。例如，如果其为RNA寡核苷酸，则其通过RNA-RNA相互作用结合另一个RNA 靶标并改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。 该定义意在包括从治疗、诊断或其他观点来看有用的任何外源RNA或DNA分子。这类分子 包括例如反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治 疗性编辑RNA(therapeutic editing RNA)以及激动剂和诘抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义 寡核苷酸、外