采用棒曲霉α-淀粉酶和支链淀粉酶由淀粉制备葡萄糖的方法
【专利说明】采用棒曲霉α-淀粉酶和支链淀粉酶由淀粉制备葡萄糖的 方法
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2012年8月16日提交的美国临时专利申请61/683, 960的权益， 该临时专利申请的内容据此以引用方式全文并入。
[0003] 序列表
[0004] 附件是包括SEQ ID NO: 1-13的序列表，其以引用方式整体并入本文。
技术领域
[0005] 将（1)来自棒曲霉（Aspergillus clavatus)的α -淀粉酶（AcAmyl)或其变体和 (2)支链淀粉酶用于淀粉的糖化，例如同时糖化和发酵（SSF)的方法。
【背景技术】
[0006] 淀粉由直链淀粉（15-30% w/w)和支链淀粉（70-85% w/w)的混合物组成。直链 淀粉由α -1，4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量（MW)为约60, 000至约800, 000。支 链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α -1，6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。
[0007] 浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，所述方法涉及：（1) 用α -淀粉酶将固体淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度为约7-10的糊精，以及（2)用 淀粉葡糖苷酶（也称为葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所得 的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆 (isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆还可用微生物如酵母发酵以生产商业终产 品。终产品可为醇，或者任选乙醇。终产品还可以是有机酸、氨基酸、生物燃料和其他生物 化工品，包括但不限于乙醇、柠檬酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡 糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸-S -内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸、ω 3脂肪酸、丁醇、异 戊二烯、1，3-丙二醇和生物柴油。可同时进行发酵和糖化（即SSF工艺）来实现更大的经 济性和效率。
[0008] α -淀粉酶通过随机裂解内部α -1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。特别 是来自杆菌属（Bacilli)的α-淀粉酶已被用于多种不同的用途，包括淀粉液化和糖化、纺 织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性、酿造、烘焙、食品工业的糖浆的生产、发酵工艺的 原料的生产以及用于动物饲料以提高可消化性。这些酶也可用于在盘碟洗涤和衣物洗涤过 程中除去含淀粉污垢和污渍。
[0009] 若干曲霉属（Aspergillus)物种，包括棒曲霉在内，显示出强效淀粉分解行为，这 种行为在酸性条件下得到保持。参见Nahira et al. (1956) "Taxonomic studies on the genus Aspergillus. VIII. The relation between the morphological characteristics and the amylolytic properties in the Aspergillus，"Hakko Kogaku Zasshi 34:391-99, 423-28, 457-63 (Nahira等人，1956年，"曲霉属的分类学研究VIII.:曲霉属 的形态特征与淀粉分解特性之间的关系"，《发酵工学杂志》，第34卷，第391-399页，第 423-428页，第457-463页）。例如，棒曲霉分泌淀粉酶活性及其他多糖降解酶，这使得该 真菌能消化其环境中的复合碳水化合物。参见Ogundero et al. (1987) "Polysaccharide degrading enzymes of a toxigenic strain of Aspergillus clavatus from Nigerian poultry feeds，"Die Nahrung 10:993-1000 (Ogundero 等人，1987 年，"来自尼日利亚禽饲 料的棒曲霉的产毒株的多糖降解酶"，《食品》，第10卷，第993-1000页）。在确定pH对棒 曲霉降解经碾磨饲料的能力的作用时，棒曲霉在从3. 2至7. 8的所有受测试pH值下均显 不出降解饲料的能力。参见 OgunderoQ987) "Toxigenic fungi and the deterioration of Nigerian poultry feeds，" Mycopathologia 100:75-83 (Ogundero, 1987 年，"产毒 真菌与尼日利亚禽饲料的变质"，《真菌病理学》，第100卷，第75-83页）。随后的研宄 显示当棒曲霉在玉蜀黍酵母提取物培养基或小麦酵母提取物培养基上生长时，棒曲霉淀 粉酶在 pH 7-8 处具有峰值活性。Adisa(1994) "MycofIora of post-harvest maize and wheat grains and the implications of their contamination by molds，''Die Nahrung38 (3) : 318-26 (Adisa，1994年，"收获后的玉蜀黍和小麦谷粒的真菌群及所述谷粒 被霉菌污染的含意"，《食品》，第38卷，第3期，第318-326页）。
【发明内容】
[0010] 来自棒曲霉的α -淀粉酶（AcAmyl)在适当温度和酸性pH下催化糖化较长的时 间。提供了来自棒曲霉NRRLl的已知α-淀粉酶的例子（SEQ ID NO: 1)、所述α-淀粉酶的 变体、编码核酸以及表达所述多核苷酸的宿主细胞。AcAmyl具有酸性工作范围，并且在同时 糖化和发酵（SSF)中有助于高乙醇产率和低残余淀粉，例如，特别是当与葡糖淀粉酶一起 使用时。尽管Adisal994公开了棒曲霉的峰值淀粉酶活性在25-30°C下出现于pH 7-8处， 但AcAmyl在50°C下具有pH最佳值pH 4. 5。AcAmyl在高温和低pH下表现出高活性，因此 AcAmyl可在真菌葡糖淀粉酶如黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶（AnGA)或者木霉 属（Trichoderma)葡糖淀粉酶（TrGA)存在下被有效用于糖化工艺。与白曲霉（Aspergillus kawachii) α -淀粉酶（AkAA)催化的糖化产物相比，AcAmyl有利地催化淀粉糖化为显著富 含DPl和DP2(即，葡萄糖和麦芽糖）的低聚糖组合物。AcAmyl可以比AkAA低的剂量使 用，以生成相当水平的乙醇。AcAmyl可以与源自植物（例如，谷物和粮食）的酶结合使用。 AcAmyl还可以与宿主细胞分泌或宿主细胞内源的酶结合使用。例如，AcAmyl可被添加到发 酵或SSF工艺，在所述工艺期间一种或多种淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋 白酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶或其他酶由生产宿主分泌。AcAmyl也可以 与内源性非分泌型生产宿主酶组合在一起工作。在另一个例子中，AcAmyl可在发酵或SSF 期间由生产宿主细胞单独分泌或者与其他酶一起分泌。AcAmy 1淀粉酶还可以有效地将淀粉 直接水解为糖浆和/或生物化学物质（例如，醇类、有机酸、氨基酸、其他生物化学物质和生 物材料），其中反应温度低于底物的胶化温度。AcAmyl可在发酵或SSF期间由宿主细胞与 其他酶一起分泌。
[0011] 因此，本发明提供了一种糖化可能包含淀粉的组合物以制备包含葡萄糖的组合物 的方法，其中所述方法可包括（i)使包含淀粉的组合物与支链淀粉酶以及分离的AcAmyl或 其变体接触，所述分离的AcAmyl或其变体具有α-淀粉酶活性并且包含与（a)SEQ ID NO: 1 的第20-636位残基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位残基具有至少80%氨基酸序列同一 性的氨基酸序列；以及（ii)糖化该包含淀粉的组合物以产生该包含葡萄糖的组合物；其中 该支链淀粉酶和该分离的AcAmyl或其变体单独地或与其他酶结合催化该淀粉组合物糖化 成葡萄糖、DP2、DP3、DP4等，或者糖化成其他低聚糖或多糖。
[0012] 为了在相同的条件下减少相同数量的残余淀粉，AcAmyl或其变体的剂量可以为 AkAA剂量的约17% -50%，或任选地约17% -34%。为了在相同的条件下减少相同数量的 DP3+，AcAmy 1或其变体的剂量也可以为AkAA剂量的约17 % -50 %，或任选地约17 % -34%。
[0013] 在一些实施例中，该AcAmyl或其变体的剂量为约1.7至约IOyg蛋白质/g固形 物。在另外的实施例中，该AcAmyl或其变体的剂量为约1. 7至约6. 6 μ g蛋白质/g固形物。 在另外的实施例中，该AcAmyl或其变体的剂量为约3. 3 μ g蛋白质/g固形物。
[0014] 该包含葡萄糖的组合物与由AkAA及支链淀粉酶在相同条件下制备的包含葡萄糖 的第二组合物相比，可富含DPI、DP2或（DP1+DP2)。
[0015] 在一些实施例中，在存在支链淀粉酶的情况下，AcAmyl或其变体的剂量是在不存 在支链淀粉酶的情况下在相同条件下减少相同数量的残余淀粉所需要的AcAmyl剂量的约 50%，并且任选地，其中该支链淀粉酶的剂量为在不存在支链淀粉酶的情况下在相同条件 下减少相同数量的残余淀粉所需要的AcAmyl剂量的约20%。在另外的实施例中，在存在支 链淀粉酶的情况下，AcAmyl或其变体的剂量是在不存在支链淀粉酶的情况下在相同条件下 减少相同数量的DP3+所需要的AcAmyl剂量的约50%，并且任选地，其中该支链淀粉酶的剂 量为在不存在支链淀粉酶的情况下在相同条件下减少相同数量的DP3+所需要的AcAmyl剂 量的约20%。在另外的实施例中，在存在支链淀粉酶的情况下，AcAmyl或其变体的剂量是 在不存在支链淀粉酶的情况下在相同条件下生产相同的乙醇产率所需要的AcAmyl剂量的 约50%，并且任选地，其中该支链淀粉酶的剂量为在不存在支链淀粉酶的情况下在相同条 件下生产相同的乙醇产率所需要的AcAmyl剂量的约20%。
[0016] AcAmyl或其变体可包含与（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位残基或（b) SEQ ID NO: 1 的第20-497位残基具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。AcAmyl 或其变体还可包含（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位残基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位 残基。AcAmyl或其变体可由与（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位残基或（b) SEQ ID NO: 1的 第20-497位残基具有至少80%、90%、95 %或99 %氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。 AcAmyl或其变体还可由（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位残基或（b) SEQID NO: 1的第20-497 位残基组成。
[0017] 该淀粉组合物可包含液化淀粉、胶化淀粉或颗粒淀粉。糖化可在约30°C至约75°C 的温度范围内进行。所述温度范围还可为47°C-74°C。糖化可在pH 2.0-pH 7. 5的pH范 围内进行。所述pH范围还可为pH 3.5-pH5. 5。所述pH范围还可为pH 4. 〇-pH 5.0。
[0018] 所述方法还可包括发酵葡萄糖组合物以制备发酵最终（EOF)产物。发酵可以是同 时糖化和发酵（SSF)反应。发酵可在pH 2-8下并且在25°C_70°C的温度范围内进行24-70 小时。EOF产物可包含8%-18% (v/v)的乙醇。EOF产物可包含代谢物。终产品可为醇， 或者任选乙醇。终产品还可以是有机酸、氨基酸、生物燃料和其他生物化工品，包括但不限 于乙醇、柠檬酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其 他羧酸、葡糖酸-δ -内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸、ω3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1，3-丙二醇 和生物柴油。
[0019] 本发明还提供AcAmyl或其变体与支链淀粉酶在发酵饮料的生产中的用途，以及 制备发酵饮料的方法，该方法可包括：使麦芽浆和/或麦芽汁与AcAmyl或其变体以及支链 淀粉酶接触。一种制备发酵饮料的方法，其可包括：(a)制备麦芽浆；(b)过滤所述麦芽浆以 得到麦芽汁；以及（c)将麦芽汁进行发酵以获得发酵饮料，其中AcAmyl或其变体以及支链 淀粉酶被添加至：（i)步骤（a)的麦芽浆和/或（ii)步骤（b)的麦芽汁和/或（iii)步骤 (c)的麦芽汁。还提供了由所公开的方法生产的发酵饮料。
[0020] 发酵